miR-103a-3p靶向RCAN1對MPP+誘導的帕金森病細胞模型損傷的影響及機制研究

徐向玲，李 強，李春梅，孫巧麗

帕金森病(parkinson's disease， PD)是常見于中老年人的神經退行性疾病，表現為運動和認知功能障礙，包括靜息性震顫、運動遲緩、姿勢步態異常、精神和感覺障礙等[1-2]。目前，PD主要是對癥治療。有報道指出PD發生可能與神經元凋亡有關[3-4]，因此研究神經元凋亡分子機制可能為PD治療提供新靶點。miRNA是一種非編碼RNA，其通過與靶基因3'-UTR結合在轉錄后水平調控基因表達[5-6]。既往研究顯示，miR-212[7]、miR-34a[8]等多種miRNA在PD的發生發展中起著重要作用。miR-103a-3p位于染色體5q34，與腫瘤[9]、PD[10]和妊娠相關并發癥[11]的發生有關。生物信息學分析顯示，鈣調蛋白1(regulator of calcineurin 1， RCAN1)是miR-103a-3p的潛在功能性靶基因。許多研究表明，RCAN1表達的增加通過促進神經元凋亡在阿爾茨海默病的發病機制中起關鍵作用[12-13]。但miR-103a-3p能否靶向RCAN1參與PD進展尚未可知。1-甲基-4-苯基碘化吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)是一種常用的多巴胺神經元毒物，可導致線粒體膜的缺失以及活性氧形成，最終導致神經元細胞凋亡，其誘導的SK-N-SH是常用的PD體外細胞模型[14]。本研究旨在探討miR-103a-3p靶向RCAN1在MPP+誘導的神經母細胞瘤細胞SK-N-SH凋亡中的作用，以期為PD治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購于上海名勁生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素溶液購于美國Gibco公司；MPP+購于美國Sigma公司；細胞計數(Cell Counting Kit 8， CCK-8)試劑盒、膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑盒、Trizol試劑購于上海碧云天生物科技有限公司；Omniscript RT試劑盒購于上海力敏實業有限公司；SYBR Green qPCR Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；兔源RCAN1、細胞周期素D1(CyclinD1)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Abcam公司；miR-103a-3p模擬物(miR-103a-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-103a-3p抑制物(anti-miR-103a-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、RCAN1小干擾RNA(si-RCAN1)及其陰性對照(si-NC)、RCAN1過表達載體(pcDNA-RCAN1)及其陰性對照(pcDNA-NC)、PCR引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2細胞培養 SK-N-SH細胞采用含10%胎牛血清、含1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基于37℃，5% CO2條件下培養。

1.3不同濃度MPP+對SK-N-SH細胞存活的影響

1.3.1CCK-8法檢測細胞存活情況：將SK-N-SH細胞按照2×103cells/孔，100 μl/孔接種到96孔板，將培養板放在培養箱預培養24 h，向培養板加入不同終濃度(0.1、0.2、0.4 mmol/L)的MPP+試劑于培養箱孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.3.2流式細胞術檢測細胞凋亡情況：收集經不同終濃度(0.1、0.2、0.4 mmol/L)MPP+處理24 h的SK-N-SH細胞，PBS洗滌細胞2次，采用結合緩沖液重懸細胞，調整密度為1×106cells/ml。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒步驟檢測細胞凋亡情況。

1.4RT-qPCR檢測miR-103a-3p和RCAN1 mRNA的表達 收集終濃度為0.2 mmol/L MPP+處理24 h的SK-N-SH細胞，Trizol法提取細胞總RNA。利用Omniscript RT試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix說明進行RT-qPCR擴增。β-actin和U6分別作為RCAN1和miR-103a-3p的內源性對照，采用2-ΔΔCt法計算miR-103a-3p和RCAN1 mRNA表達量。引物序列(5'-3')：miR-103a-3p上游ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游TGCTAGCAGCATTGTACAGG；U6上游GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；RCAN1上游GGTGGTCCACGTGTGTGAGA，下游ACGTGAACAAAGGCTGGTCCT；β-actin上游CCAACCGCGAGAAGATGA，下游CCAGAGGCGTACAGGGATAG。

1.5Western blot檢測RCAN1蛋白的表達 收集終濃度為0.2 mmol/L的MPP+處理24 h的SK-N-SH細胞，RIPA裂解液提取各組細胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸3 min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離的細胞蛋白轉移至硝酸纖維素膜，4℃封閉過夜，分別加入稀釋的RCAN1抗體、β-actin抗體雜交，洗膜后，加入相對應的二抗室溫反應1 h，洗膜后，進行化學發光顯色。采用凝膠成像系統分析各目的條帶灰度值。以目標蛋白灰度值和β-actin灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

1.6miR-103a-3p和RCAN1對SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響 將miR-NC、miR-103a-3p mimics、si-NC、si-RCAN1分別轉染SK-N-SH細胞，采用0.2 mmol/L的MPP+處理24 h后，依次記為MPP++miR-NC組、MPP++miR-103a-3p組、MPP++si-NC組、MPP++si-RCAN1組。同時將miR-103a-3p mimics分別與pcDNA-NC、pcDNA-RCAN1共轉染SK-N-SH細胞，轉染MPP+處理24 h，依次記為MPP++miR-103a-3p+pcDNA-NC組、MPP++miR-103a-3p+pcDNA-RCAN1組，檢測細胞活力和凋亡情況。將各組SK-N-SH細胞按照2×103cells/孔接種于96孔板，培養箱中預培養一段時間后，檢測各組細胞活力，觀察細胞存活情況。

1.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證RCAN1對miR-103a-3p的靶向作用 為證實miR-103a-3p對RCAN1的靶向作用，將含miR-103a-3p結合位點的野生型(WT-RCAN1)或含miR-103a-3p結合位點突變序列的突變型(MUT-RCAN1)熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC、miR-103a-3p mimics共轉染SK-N-SH細胞，24 h后收獲細胞，按熒光素酶活性檢測試劑盒說明書測定各組細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1不同濃度MPP+對SK-N-SH細胞存活和凋亡的影響 與NC組比較，不同濃度MPP+處理組SK-N-SH細胞的存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。選擇0.2 mmol/L MPP+進行后續實驗。見表1和圖1。

圖1 4組SK-N-SH細胞凋亡情況流式細胞儀檢測結果MPP+為1-甲基-4-苯基碘化吡啶

表1 不同濃度MPP+對SK-N-SH細胞存活率和凋亡率的影響

2.2MPP+誘導的PD細胞模型SK-N-SH細胞中miR-103a-3p和RCAN1表達情況 與NC組比較，MPP+組SK-N-SH細胞miR-103a-3p的表達顯著降低，RCAN1 mRNA和蛋白的表達顯著升高(P<0.01)。見表2和圖2。

圖2 MPP+誘導的PD細胞模型SK-N-SH細胞中RCAN1蛋白的表達PD為帕金森病，MPP+為1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1為鈣調蛋白1，β-actin為β-肌動蛋白

表2 MPP+誘導的PD細胞模型SK-N-SH細胞中miR-103a-3p和RCAN1表達情況

2.3過表達miR-103a-3p對PD細胞模型SK-N-SH細胞存活和凋亡的影響 與MPP++miR-NC組比較，MPP++miR-103a-3p組SK-N-SH細胞miR-103a-3p、CyclinD1蛋白表達、細胞存活率顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表3和圖3。

表3 過表達miR-103a-3p對PD細胞模型SK-N-SH細胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達及細胞存活的影響

圖3 過表達miR-103a-3p對PD細胞模型SK-N-SH細胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響PD為帕金森病，MPP+為1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1為鈣調蛋白1，β-actin為β-肌動蛋白

2.4干擾RCAN1表達對PD細胞模型SK-N-SH細胞存活和凋亡的影響 與MPP++si-NC組比較，MPP++si-RCAN1組SK-N-SH細胞RCAN1、Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率降低，CyclinD1蛋白表達和細胞存活率升高(P<0.01)。見表4和圖4。

圖4 PD細胞模型SK-N-SH細胞中RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達PD為帕金森病，MPP+為1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1為鈣調蛋白1，CyclinD1為細胞周期素D1，Cleaved-caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

表4 干擾RCAN1表達對PD細胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達及細胞模型SK-N-SH細胞存活的影響

2.5miR-103a-3p靶向RCAN1并調控其表達 采用starbase進行靶基因預測發現，miR-103a-3p與RCAN1的3'-UTR區域存在特異性結合的核苷酸序列，見圖5A。Western Blot檢測miR-103a-3p對RCAN1的調控作用顯示，miR-NC組、miR-103a-3p minmics組、anti-miR-NC組、anti-miR-103a-3p組RCAN1蛋白表達水平分別為0.35±0.05、0.12±0.01、0.34±0.04、0.73±0.07。與miR-NC組比較，miR-103a-3p組SK-N-SH細胞RCAN1蛋白的表達顯著降低(P<0.01)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-103a-3p組SK-N-SH細胞RCAN1蛋白的表達顯著升高(P<0.01)，見圖5B。雙熒光素酶報告基因驗證二者的靶向關系顯示，與miR-NC和WT-RCAN1共轉染組比較，miR-103a-3p mimics和WT-RCAN1共轉染組SK-N-SH細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-RCAN1共轉染組比較，miR-103a-3p mimics和MUT-RCAN1共轉染組SK-N-SH細胞的熒光素酶活性變化無統計學意義(P>0.05)，見表5。提示在SK-N-SH細胞中miR-103a-3p靶向RCAN1并負調控其表達。

表5 2組SK-N-SH細胞雙熒光素酶活性比較

圖5 miR-103a-3p靶向SK-N-SH細胞中RCAN1、調控RCAN1蛋白的表達A.starbase對miR-103a-3p和RCAN1結合進行預測示意圖；B.Western Blot檢測RCAN1蛋白表達；RCAN1為鈣調蛋白1，β-actin為β-肌動蛋白

2.6過表達RCAN1可部分逆轉miR-103a-3p對PD細胞模型SK-N-SH細胞存活和凋亡的影響 與MPP++miR-103a-3p+pcDNA-NC組比較，MPP++miR-103a-3p+pcDNA-RCAN1組SK-N-SH細胞RCAN1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達及凋亡率顯著升高，CyclinD1蛋白的表達及細胞存活率顯著降低(P<0.01)。見表6和圖6。

圖6 PD細胞損傷模型SK-N-SH細胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達情況PD為帕金森病，MPP+為1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1為鈣調蛋白1，CyclinD1為細胞周期素D1，Cleaved-caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，β-actin為β-肌動蛋白

表6 過表達RCAN1可部分逆轉miR-103a-3p對PD細胞損傷模型SK-N-SH細胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達及細胞存活的影響

3 討論

隨著人類壽命的延長，PD作為一種神經退行性疾病引起了人們的廣泛關注。大量證據表明包括PD在內的多種神經系統疾病中miRNA在調節多種基本生物學和病理學過程中發揮重要作用，且多種miRNA在PD患者或動物腦脊液中表達異常，參與多巴胺神經元發育[15]。因此，闡明miRNA在PD中的作用有望為PD的臨床診療提供新的靶點。

miR-103a-3p的異常表達與多種神經系統疾病的發生相關。Chang等[16]通過對阿爾茨海默病miRNA差異表達分析發現，miR-103a-3p的表達顯著下調。Liguori等[17]通過高通量測序和生物統計分析發現，肌萎縮性側索硬化癥患者外周血樣品中miR-103a-3p也呈低表達。此外，Yu等[18]指出miR-103a-3p在神經膠質瘤組織和細胞中呈低表達，上調其表達可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，抑制神經膠質瘤惡性行為。為證實miR-103a-3p在PD中的作用，本研究采用MPP+誘導SK-N-SH，結果顯示MPP+處理引起細胞存活率呈劑量依賴性降低，并誘導細胞凋亡增加，與既往MPP+誘導的細胞凋亡機制一致[19]，選擇0.2 mmol/L MPP+進行建模。進一步研究發現，MPP+處理的SK-N-SH細胞中miR-103a-3p的表達顯著下調，過表達miR-103a-3p可減輕MPP+處理對SK-N-SH細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，逆轉MPP+處理對CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響。以上研究說明過表達miR-103a-3p在MPP+誘導的PD細胞模型損傷中具有保護作用。Serafin等[10]報道miR-103a-3p在左旋多巴治療PD患者外周血中表達上調，本研究結果與其一致。

RCAN1基因位于21號染色體上，由7個外顯子和6個內含子組成。早期研究顯示，阿爾茨海默病和唐氏綜合征患者大腦組織中RCAN1表達增加，正常衰老的人腦組織中RCAN1表達水平也升高[20]。近年來多項研究指出，在衰老過程中RCAN1表達增加導致線粒體功能障礙和氧化應激，從而促進神經退行性變和阿爾茨海默病的發生[21-22]。本研究結果顯示，MPP+誘導的PD細胞模型SK-N-SH細胞中RCAN1的表達顯著增加。進一步探討RCAN1在PD進展中作用發現干擾RCAN1表達可減輕MPP+誘導對SK-N-SH細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，并減輕MPP+處理對CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響。隨后的雙熒光素酶報告基因分析和Western blot分析顯示，miR-103a-3p以轉錄后的方式抑制RCAN1表達。此外，進一步恢復實驗顯示過表達可逆轉miR-103a-3p對PD細胞損傷模型SK-N-SH細胞增殖、凋亡以及相關蛋白表達的影響。

綜上所述，miR-103a-3p通過靶向RCAN1進而減弱MPP+誘導的神經元細胞凋亡，提示miR-103a-3p/RCAN1是PD診療的潛在靶點。然而，需要更多的體內數據來進一步驗證miR-103a-3p/RCAN1分子軸在PD進展中的作用。