白蒺藜皂苷對2型糖尿病大鼠視網膜的保護作用及TrkB信號通路的影響

趙艷霞，王 鋒，王 爽

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，常伴隨著高血糖、高脂血癥、炎癥，導致循環系統病理變化，進而誘導腦、心臟、神經、腎和視網膜血管損傷[1-3]。視網膜病變是糖尿病最常見的并發癥，也是成人失明的主要原因，其特征在于黃斑水腫、視網膜缺血和異常新血管形成。糖尿病視網膜病變的早期跡象發現于前驅糖尿病患者，糖尿病視網膜病變可能與腦缺血、皮質萎縮和認知功能下降有關[4]。肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B， TrkB)途徑可能在視網膜和其他神經組織中具有保護作用，其激活后，神經營養素-4(NT-4)出現局部增加，腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)水平升高，2種配體對TrkB受體具有高親和力[5-6]。白蒺藜皂苷具有水溶性，具有類固醇或三萜糖苷配基結構，具有一個或多個水溶性碳水化合物的側鏈。藥理學研究表明，白蒺藜皂苷具有抗癌、抗氧化、降血糖的功效[7]。在動物模型中，白蒺藜皂苷可增強軸突再生并減少周圍神經橫斷后的神經元死亡，提高學習和記憶任務，并促進中樞神經系統的神經發生[8]。本研究擬探討白蒺藜皂苷對2型糖尿病大鼠視網膜的保護作用及TrkB信號通路的影響，為2型糖尿病視網膜病變的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 白蒺藜皂苷、鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號L0209、L0317)；二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號190203)；伊凡斯蘭、BCA蛋白濃度測定試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司，批號190122、181229)；FITC膜聯蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司，批號AW58741、A0715)；TRIzol試劑、poly-A聚合酶(美國Invitrogen公司，批號SI6017、SI0156)；PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒、M-MLV逆轉錄酶(寶生物工程大連有限公司，批號M3317、M4219)；聚偏二氟乙烯膜、β-actin抗體(上海百研生物科技有限公司，批號SH30396、SH20149)；BDNF、p-TrkB抗體(美國Epitomics公司，批號V900400、V900407)；山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗(美國Abcam公司，批號ab70544)；ECL Detection Reagent化學發光超敏顯色試劑盒(美國Millipore公司，批號ST40074)。HGM-114血糖儀(歐姆龍健康醫療有限公司)；Lenstar-587新型眼球生物測量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；Applied Biosystems 7500實時PCR系統(美國應用生物系統公司)；LAS-4000圖像分析儀(美國通用公司)。

1.2實驗動物及分組 清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠100只，8周齡，體重210～240 g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(吉)2018-0001，動物使用許可證號：SYXK(吉)2018-0003，動物質量合格證號：00341527。所有大鼠無視網膜病變，無眼底異常，隨機分成對照組、模型組、二甲雙胍組(20 mg/kg)、白蒺藜皂苷低劑量組(20 mg/kg)、白蒺藜皂苷高劑量組(40 mg/kg)，每組20只。

1.3模型制備 模型組、二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(溶于0.01 mol/L檸檬酸鹽，pH值為4.4)誘導糖尿病，對照組大鼠注射等體積的生理鹽水，48 h后檢測大鼠尾靜脈血血糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L說明糖尿病模型建立成功[9]。同時檢測視網膜，如果F-ERG波和Ops波的潛伏期延長且振幅減小，則認為2型糖尿病視網膜病變模型建立成功[9]。建模成功后，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組給予相應藥物腹腔灌胃，灌胃體積10 ml/kg，對照組和模型組給予10 ml/kg的生理鹽水，每天1次，持續12周。

1.4大鼠血糖以及伊凡斯蘭滲透量的測定 實驗結束后，禁食12 h，尾靜脈采血檢測血糖。將30 g/L伊凡斯蘭于尾靜脈快速注入，2 h后，麻醉大鼠，摘除眼球，分離視網膜，37℃烘干，甲酰胺65℃孵育15 h，離心取上清液于628 nm處用分光光度計測量吸光度(A)值之差。

1.5大鼠視網膜病理切片制作及觀察 常規脫水、包埋、切片后，二甲苯(Ⅰ)15 min、二甲苯(Ⅱ)15 min、二甲苯∶無水乙醇=1∶1 2 min、100%乙醇(Ⅰ)5 min、100%乙醇(Ⅱ)5 min、80%乙醇5 min、蒸餾水5 min、蘇木精染色5 min、水洗10 min或流水沖洗5 min、1%鹽酸乙醇30 s、水洗30 s、蒸餾水過洗5 s、0.5%伊紅染色1～3 min、蒸餾水稍洗30 s、80%乙醇稍洗30 s、95%乙醇(Ⅰ)1 min、95%乙醇(Ⅱ)1 min、無水乙醇(Ⅰ)3 min、無水乙醇(Ⅱ)3 min、二甲苯(Ⅰ)3 min、二甲苯(Ⅱ)3 min、中性樹膠封固。顯微鏡下觀察大鼠視網膜結構變化。

1.6大鼠視網膜細胞凋亡水平檢測 視網膜石蠟切片脫蠟，溫和胰蛋白酶消化后，FACSCalibur流式細胞儀以及FITC膜聯蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒檢測大鼠視網膜細胞凋亡水平。

1.7大鼠視網膜BDNF、p-TrkB mRNA水平檢測 根據制造商的說明書，使用TRIzol試劑提取總RNA，使用PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒根據制造商的說明書進行RT-PCR反應。在具有oligo-dT銜接子的poly-A聚合酶存在下逆轉錄總RNA(500 ng)。用M-MLV逆轉錄酶將500 ng總RNA逆轉錄成cDNA的第一鏈。引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。使用的引物序列如下：BDNF正向5'-TGAGAAGCACGACCTTCATGT-3'，反向5'-GGAACCCCTATGACCTCTTCA-3'；p-TrkB正向5'-GGTTGAGTGACCTTGGTGA-3'，反向5'-AAGTGGACCTATGACCCCTCTA-3'；β-actin正向5'-CCCAGATCATGTTTGAGACCT-3'，反向5'-GAGTCCATCACGATGCCAGT-3'。使用Applied Biosystems 7500實時PCR系統進行qRT-PCR，β-actin用作內部對照，使用2-ΔΔCt方法計算BDNF、p-TrkB表達的相對定量。所有實驗重復3次。

1.8大鼠視網膜BDNF、p-TrkB蛋白水平檢測 使用1%RIPA裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白(50 mg)，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜。將膜用5%牛奶在室溫下封閉2 h，然后在4℃下與BDNF、p-TrkB、β-actin一抗孵育過夜。將膜在含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液中洗滌3次，并與山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL Detection Reagent化學發光超敏顯色試劑盒使蛋白可視化，并使用LAS-4000圖像分析儀檢測信號，將數據標準化為β-actin。

2 結果

2.1血糖以及視網膜組織伊凡斯蘭滲透量 與對照組比較，模型組血糖、伊凡斯蘭滲透量水平升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低劑量組、白蒺藜皂苷高劑量組血糖、伊凡斯蘭滲透量水平降低(P<0.01)；與二甲雙胍組比較，白蒺藜皂苷低、高劑量組血糖、伊凡斯蘭滲透量升高，但白蒺藜皂苷高劑量組低于白蒺藜皂苷低劑量組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 5組大鼠血糖和視網膜組織伊凡斯蘭滲透量比較

2.2視網膜結構情況 對照組大鼠視網膜結構正常；模型組視網膜各層細胞排列紊亂，血管內皮細胞增生、外核層細胞脫落、有炎性細胞浸潤；二甲雙胍組視網膜結構趨于正常，血管內皮細胞增生明顯減少；白蒺藜皂苷低、高劑量組與模型組比較，細胞排列較正常，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 白蒺藜皂苷對大鼠視網膜結構的影響(HE×400)A.對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.白蒺藜皂苷低劑量組；E.白蒺藜皂苷高劑量組

2.3視網膜神經節細胞凋亡情況 對照組、模型組、二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組視網膜神經節細胞凋亡率分別為(1.54±0.59)%、(59.89±12.52)%、(15.96±5.85)%、(41.96±5.96)%、(28.85±3.55)%。與對照組比較，模型組視網膜神經節細胞凋亡水平升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低劑量組、白蒺藜皂苷高劑量組視網膜神經節細胞凋亡水平降低(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，白蒺藜皂苷低、高劑量組視網膜神經節細胞凋亡水平升高，但白蒺藜皂苷高劑量組低于白蒺藜皂苷低劑量組(P<0.05)。

2.4視網膜組織BDNF、p-TrkB mRNA水平 與對照組比較，模型組BDNF、p-TrkB mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組BDNF、p-TrkB mRNA水平升高(P<0.01)；與二甲雙胍組比較，白蒺藜皂苷低、高劑量組BDNF、p-TrkB mRNA水平降低，但白蒺藜皂苷高劑量組高于白蒺藜皂苷低劑量組(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 白蒺藜皂苷對大鼠視網膜BDNF、p-TrkB mRNA水平的影響

2.5視網膜組織BDNF、p-TrkB蛋白水平 與對照組比較，模型組BDNF、p-TrkB蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組BDNF、p-TrkB蛋白水平升高(P<0.01)；與二甲雙胍組比較，白蒺藜皂苷低、高劑量組BDNF、p-TrkB蛋白水平降低，但白蒺藜皂苷高劑量組高于白蒺藜皂苷低劑量組(P<0.05，P<0.01)。見表3、圖2。

圖2 白蒺藜皂苷對大鼠視網膜BDNF、p-TrkB蛋白水平的影響A.對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.白蒺藜皂苷低劑量組；E.白蒺藜皂苷高劑量組；BDNF為腦源性神經營養因子，TrkB為肌球蛋白受體激酶B

表3 白蒺藜皂苷對大鼠視網膜BDNF、p-TrkB蛋白水平的影響

3 討論

白蒺藜皂苷具有平肝解郁、活血祛風、明目、止癢的功效，用于頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰等[10]。近期研究發現，白蒺藜皂苷具有滋養陰氣，調節血液循環，驅散血瘀的作用[11]。

現代藥理學研究證實，白蒺藜皂苷可抑制氧化應激，抑制細胞凋亡和衰老，改善微循環，促進組織修復和再生。一些初步研究證實，白蒺藜皂苷可有效修復受損的胰島β細胞，降低糖尿病大鼠的血糖水平，對血管具有保護作用。在糖尿病患者中，白蒺藜皂苷可降低胰島素抵抗，改善微血管功能障礙，并減少神經病變的癥狀。白蒺藜皂苷已被證明在多種視網膜疾病模型中具有保護作用，包括光誘導的視網膜變性、眼壓損傷。白蒺藜皂苷可減輕視網膜神經細胞凋亡和凋亡相關基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組血糖、視網膜組織伊凡斯蘭滲透量、神經節細胞凋亡率升高；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組血糖、視網膜組織伊凡斯蘭滲透量、神經節細胞凋亡率降低，且白蒺藜皂苷高劑量組低于白蒺藜皂苷低劑量組。提示白蒺藜皂苷能降低2型糖尿病大鼠血糖水平，同時對視網膜具有保護作用。病理學結果顯示，模型組視網膜各層細胞排列紊亂，血管內皮細胞增生、外核層細胞脫落、有炎性細胞浸潤；二甲雙胍組視網膜結構趨于正常，血管內皮細胞增生減少；白蒺藜皂苷低、高劑量組較模型組細胞排列較正常，炎性細胞浸潤減少。提示白蒺藜皂苷能減輕2型糖尿病大鼠視網膜炎癥反應。

TrkB在視網膜中廣泛表達，已在內層和外層視網膜神經節細胞、光感受器外段，以及增生性玻璃體視網膜病變期間的Müller細胞發現TrkB表達[12]。此外，TrkB可抑制STZ糖尿病大鼠視網膜外植體中的神經元凋亡，NT-4和BDNF均可在視神經橫斷中保護視網膜神經節細胞[13-14]。許多研究指出，TrkB信號轉導途徑及其配體作為視網膜保護的介質。通過ANA-12(特異性TrkB抑制劑)抑制TrkB途徑，阻止配體BDNF與TrkB受體結合，阻止二甲雙胍對視網膜變性的光誘導和遺傳模型的保護作用[15-16]。關于運動對糖尿病視網膜保護的研究顯示，糖尿病誘導視網膜變性后接受平板運動的小鼠在視網膜、海馬和血清中表現出更高水平的BDNF、TrkB。在跑步機運動的糖尿病大鼠視網膜中也有高水平的BDNF、TrkB表達[17-18]。這些研究表明TrkB和BDNF表達水平都可以通過運動上調。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白水平降低；與模型組比較，二甲雙胍組、白蒺藜皂苷低、高劑量組BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白水平升高，且白蒺藜皂苷高劑量組高于白蒺藜皂苷低劑量組。與上述研究結果一致，提示白蒺藜皂苷能促進2型糖尿病大鼠視網膜BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白高表達，進而激活TrkB信號通路。

綜上所述，白蒺藜皂苷能降低2型糖尿病大鼠血糖水平，對視網膜有保護作用，其機制與白蒺藜皂苷能促進2型糖尿病大鼠視網膜BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白高表達，進而激活TrkB信號通路相關。