一氧化氮誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α活化的實驗研究

董 越，王朝駒，王德偉，王 黎，李 凱，伏建峰，史清海

大腦缺氧失代償將造成神經(jīng)功能紊亂及損傷。缺氧代償是動態(tài)平衡的，其中低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是細(xì)胞感知缺氧的分子感受器，而HIF-1α活化是細(xì)胞缺氧代償與適應(yīng)性的關(guān)鍵分子，參與多種缺氧代償相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1-5]。一氧化氮(nitric oxide, NO)被認(rèn)為是一種細(xì)胞間的信使分子，經(jīng)典模式是具有舒張血管的作用[6-8]。另有研究表明，NO可誘導(dǎo)HIF-1α活化表達(dá)，發(fā)生類似缺氧感知反應(yīng)的作用[2,9-11]。本研究將大鼠原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, ASTs)分別給予外源性NO供體藥物預(yù)處理和內(nèi)皮源性腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cell, MECs)共培養(yǎng)的方式，觀測ASTs細(xì)胞HIF-1α活化表達(dá)的變化，從而探索缺氧腦損傷與缺氧代償之間的動態(tài)平衡，借此發(fā)現(xiàn)缺氧腦損傷藥物防護(hù)新靶點與新策略。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑

1.1.1原代ASTs：取1日齡新生Wistar大鼠5只，窒息死亡后斷頭，手術(shù)取出大腦，眼科剪處理成1～3 mm3團(tuán)塊，0.25%胰酶、37℃消化15 min，70 μm孔徑濾網(wǎng)過濾收集單個混合膠質(zhì)細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁生長，隨后37℃、150 r/min、18 h振蕩純化，獲得第1代細(xì)胞。繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第4代后開展實驗。

1.1.2原代MECs：取3周齡Wistar大鼠10只，3%戊巴比妥麻醉后斷頭，取大腦并小心剝離腦膜和血管，眼科剪處理至1～3 mm3的糜狀組織團(tuán)塊，Ⅱ型膠原蛋白酶+DNA酶Ⅰ、37℃、200 r/min振蕩消化1 h，20% BSA重懸細(xì)胞，離心后吸取貼近管底沉淀層。重懸后，膠原蛋白酶/分解酶+DNA酶Ⅰ、37℃、200 r/min振蕩消化1 h，70 μm孔徑濾網(wǎng)過濾收集未過篩混合物，33% Percoll梯度密度離心，使用長針管吸取管底白色層，加入含嘌呤霉素(4 μg/ml)ECM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先包被纖連蛋白(2 μg/cm2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁生長，獲得第1代細(xì)胞。繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第4代后開展實驗。

1.1.3主要試劑和設(shè)備：DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibico；ECM培養(yǎng)基購自美國ScienCell；胎牛血清購自杭州四季青；2,2′-(Hydroxynitrosohydrazino)bis-ethanamine(DETA NONOate)、NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester(L-NAME)、Ⅱ型膠原蛋白酶、DNA酶Ⅰ、纖連蛋白購自美國Sigma公司；膠原蛋白酶/分解酶購自德國Roche公司；牛血清白蛋白購自美國Genview公司；嘌呤霉素二鹽酸購自比利時ACROS公司；L-精氨酸購自美國Amresco公司；Percoll分離液購自北京鼎國。HIF-1α兔多抗(ab2185)、β-actin小鼠單抗(ab3280)、HRP-羊抗兔二抗(ab6721)、HRP-兔抗鼠二抗(ab6728)購自美國Abcam公司。Nitriate/Nitrate熒光檢測試劑盒購自美國Biovision公司。70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)購自美國BD公司；ThinCert共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板購自德國Greiner公司。蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)印槽/轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Varioskan Flash熒光酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientic公司。

1.2給藥和細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1藥物處理：6孔板實驗組每孔加DETA NONOATE 150 μl至終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，對照組給予150 μl PBS。DMEM/F12完全培養(yǎng)基、ECM完全培養(yǎng)基需添加L-精氨酸至終濃度500 μmol/L；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑(L-NAME)給藥終濃度至100 μmol/L。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)條件：常氧組為21% O2、5% CO2、74% N2；低氧組為1% O2、5% CO2、94% N2。

1.2.3細(xì)胞共培養(yǎng)：將ASTs接種在6孔細(xì)胞共培養(yǎng)板上層孔內(nèi)(0.4 μm孔徑)，MECs接種在已包被纖連蛋白的共培養(yǎng)板下層孔內(nèi)，使用ECM完全培養(yǎng)液，常氧37℃、5% CO2培養(yǎng)。抑制劑組預(yù)先給藥L-NAME終濃度至100 μmol/L。培養(yǎng)12 h后，收集上層ASTs。

1.3檢測指標(biāo)和方法

1.3.1細(xì)胞增殖活性：將細(xì)胞接種于96孔板，實驗組每孔加DETA NONOATE 10 μl至終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L，對照組給予10 μl PBS。常氧37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h后棄除上清，加150 μl DMSO振蕩呈色。在490 nm波長下檢測各孔吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞相對增殖活性百分率。

1.3.2檢測NO釋放水平：ASTs經(jīng)藥物處理和常氧、低氧培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液上清，檢測NO水平。96孔板每孔加入75 μl待測樣品、5 μl Enzyme Cofactors、5 μl Nitrate reductase，室溫孵育2 h；每孔加入5 μl Enhancer，避光室溫孵育30 min；每孔加入5 μl DAN試劑，避光室溫孵育10 min；每孔加入5 μl NAOH試劑，避光室溫孵育10 min。在Ex360 nm、Em450 nm波長下讀取各孔熒光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品Nitrite/Nitrate濃度反映NO釋放水平。

1.3.3檢測HIF-1α蛋白水平：采用上樣緩沖液裂解細(xì)胞直接獲得上樣蛋白樣品，8% SDS-PAGE凝膠電泳，恒流濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉，孵育一抗：HIF-1α一抗(1∶1000)，β-actin一抗(1∶2000)，孵育二抗：HRP-羊抗兔和兔抗鼠IgG二抗(1∶5000)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1低氧和低氧培養(yǎng)時間對ASTs細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響 大鼠原代腦ASTs在常氧和低氧條件下培養(yǎng)12 h后，低氧組HIF-1α蛋白水平較常氧組增高(P<0.01)；低氧條件下培養(yǎng)12、24、48 h后，HIF-1α蛋白表達(dá)水平均較常氧組增高，其中培養(yǎng)12 h蛋白表達(dá)水平最高(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

圖1 低氧及低氧培養(yǎng)時間對ASTs細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)相對強(qiáng)度的影響ASTs為星形膠質(zhì)細(xì)胞,HIF-1α為低氧誘導(dǎo)因子-1α；常氧組氧氣濃度為21%，低氧組為1%；與常氧組比較，aP<0.05,bP<0.01;與低氧組24 h比較，dP<0.01;與低氧組48 h比較，fP<0.01

2.2DETA NONOATE對ASTs細(xì)胞增殖活性的影響 DETA NONOATE在0.4～1.2 mmol/L濃度時，大鼠原代腦ASTs的增殖活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DETA NONOATE在1.4 mmol/L濃度時大鼠原代腦ASTs增殖活性較未給藥組顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度DETA NONOATE組大鼠原代腦ASTs增殖活性比較ASTs為星形膠質(zhì)細(xì)胞；與未給藥組比較，aP<0.05

2.3DETA NONOATE對HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 常氧條件下，大鼠原代腦ASTs給予0.8、1.0 mmol DETA NONOATE預(yù)處理12 h后及低氧組HIF-1α蛋白水平高于未給藥組(P<0.01)。1.0 mmol DETA NONOATE給藥預(yù)處理12、24 h后及低氧組HIF-1α蛋白水平高于未給藥組(P<0.01)。見圖3。

圖3 DETA NONOATE對ASTs細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響ASTs為星形膠質(zhì)細(xì)胞，HIF-1α為低氧誘導(dǎo)因子-1α；常氧組氧氣濃度為21%，低氧組為1%；與未給藥組比較，bP<0.01

2.4不同氧氣條件下MECs和ASTs細(xì)胞NO釋放水平 常氧組和低氧組大鼠原代MECs總NO釋放水平均高于大鼠原代腦ASTs,低氧組MECs總NO釋放水平高于常氧組(P<0.01)。常氧條件下，MECs在給予eNOS抑制劑L-NAME(100 μmol/L)預(yù)處理后總NO釋放水平降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 常氧組和低氧組MECs和ASTs細(xì)胞NO釋放水平比較MECs為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，ASTs為星形膠質(zhì)細(xì)胞，NO為一氧化氮；常氧組氧氣濃度為21%，低氧組為1%；與常氧組MECs比較，bP<0.01;與常氧組ASTs比較，dP<0.01;與低氧組ASTs比較，fP<0.01；與未加L-NAME組比較，hP<0.01

2.5MECs對ASTs細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響 常氧條件下，將大鼠原代MECs和大鼠原代腦ASTs共培養(yǎng)，共培養(yǎng)組ASTs中HIF-1α蛋白水平較單獨ASTs培養(yǎng)組增高(P<0.01)；共培養(yǎng)組給予L-NAME(100 μmol/L)預(yù)處理后，ASTs中HIF-1α蛋白水平與ASTs單獨培養(yǎng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 常氧條件下MECs對ASTs細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平的影響MECs為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，ASTs為星形膠質(zhì)細(xì)胞，HIF-1α為低氧誘導(dǎo)因子-1α；與ASTs細(xì)胞單獨培養(yǎng)組比較，bP<0.01

3 討論

細(xì)胞感知缺氧的感受器稱之為HIF，包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，其中研究較多的是HIF-1。HIF-1是由α、β亞基構(gòu)成的異源二聚體，其中α亞基受氧氣濃度調(diào)控，核心機(jī)制是氧氣作為脯氨酰羥化酶(PHD)的輔助分子參與羥化α亞基的脯氨酸殘基，羥化后的α亞基經(jīng)過泛素化途徑降解[3,12]；缺氧將阻斷α亞基的降解，活化的α亞基具有轉(zhuǎn)位胞核、與β亞基結(jié)合、調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)等作用[4-5,13]。本研究針對大鼠原代分離的腦ASTs，在體外1%氧氣條件下培養(yǎng)可出現(xiàn)典型的缺氧感知即HIF-1α活化反應(yīng)；尤其是缺氧12 h后，HIF-1α活化表達(dá)水平最高。但是，缺氧24、48 h后HIF-1α活化表達(dá)水平下降，出現(xiàn)HIF-1α活化的單個脈沖模式。根據(jù)以往的文獻(xiàn)，我們推測HIF-1α介導(dǎo)細(xì)胞急性期缺氧反應(yīng)，適應(yīng)缺氧的持續(xù)性反應(yīng)是由HIF-2α介導(dǎo)的細(xì)胞慢性期缺氧反應(yīng)[14]，而HIF-2α同樣是氧依賴性核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種缺氧相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但相關(guān)機(jī)制仍需深入研究。

NO是一種細(xì)胞信使分子，在體內(nèi)的生成是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生。根據(jù)組織來源差異，NOS通常包括神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和eNOS[6]。經(jīng)典的NO分子作用機(jī)制是：血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO活化血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，激活蛋白激酶G(PKG)途徑，調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)，抑制肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合，舒張血管平滑肌[7-8]。此外，另有研究證實NO參與調(diào)控HIF-1α的活化表達(dá)，機(jī)制可能是阻斷Fe2+綁定PHD，從而阻斷α亞基的降解[2,9-11]。本研究針對大鼠原代分離的腦ASTs，在體外常氧條件下，給予NO供體藥物DETA NONOATE預(yù)處理，我們觀測到了典型的HIF-1α活化反應(yīng)，尤其是1.0 mmol/L DETA NONOATE預(yù)處理12 h，HIF-1α活化表達(dá)水平最高，與低氧條件下觀測到的缺氧感知即HIF-1α活化反應(yīng)現(xiàn)象一致，表明體外培養(yǎng)的ASTs在外源性給予NO能夠誘導(dǎo)發(fā)生類似缺氧反應(yīng)的HIF-1α活化現(xiàn)象。

為了進(jìn)一步研究NO調(diào)控HIF-1α活化表達(dá)的生理現(xiàn)象，我們采用細(xì)胞共培養(yǎng)模式模擬腦組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO誘導(dǎo)ASTs細(xì)胞HIF-1α活化的實驗研究。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ASTs是構(gòu)成腦組織的主要支撐結(jié)構(gòu)，血管、神經(jīng)元以及其他細(xì)胞有序分布其中，ASTs包裹腦血管，直接與MECs接觸并可發(fā)生物質(zhì)轉(zhuǎn)運[15-16]。細(xì)胞共培養(yǎng)實驗是研究相鄰不同細(xì)胞間物質(zhì)與信息傳遞的有效實驗方法[17]。本研究將大鼠原代腦MECs和原代腦ASTs通過Transwell技術(shù)進(jìn)行共培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的MECs在給予內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物(ECGs)和500 μmol/L L-精氨酸條件下，可以生成一定量生理水平的NO。共培養(yǎng)12 h后的ASTs觀測到了典型的HIF-1α活化反應(yīng)，與低氧條件下觀測到的缺氧感知即HIF-1α活化反應(yīng)現(xiàn)象一致；與此同時，抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性后，HIF-1α活化反應(yīng)被抑制，表明體外培養(yǎng)的ASTs在給予內(nèi)皮源性NO后能夠誘導(dǎo)發(fā)生類似缺氧反應(yīng)的HIF-1α活化現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報道一致[9]。

本研究初步觀測到體外培養(yǎng)的ASTs在給予2種來源NO后均可誘導(dǎo)HIF-1α活化。但NO調(diào)控HIF-1α活化的機(jī)制，以及與低氧適應(yīng)性HIF-1α活化的過程有無差別，HIF-1α活化的持續(xù)時間、活化表達(dá)強(qiáng)度等具體問題仍需要我們深入研究。此外，體外培養(yǎng)MECs生成NO，釋放擴(kuò)散并在ASTs內(nèi)發(fā)揮作用與在生理條件下NO的作用有何異同，NO的生成水平、作用持續(xù)時間等也是需要解決的科學(xué)問題。上述問題的充分闡釋，將使我們深入認(rèn)識缺氧感知與HIF-1α活化機(jī)制，了解缺氧腦損傷與缺氧代償之間的動態(tài)平衡，發(fā)現(xiàn)缺氧腦損傷藥物干預(yù)的防護(hù)新靶點與新策略。