利用SSR標記分析江蘇水稻聯合體試驗品系遺傳多樣性

吳錦泉 張小強 胡忠磊

摘 要：選育和推廣優良水稻品種對于保障我國糧食安全具有深遠影響，研究水稻種質資源遺傳多樣性對水稻的選育和利用具有重要的指導價值。本研究采用“江蘇省水稻品系真實性SSR標記方法”中60個對江蘇水稻品種具有良好特異性的SSR分子標記，對2019年江蘇省水稻聯合體試驗中共計256個品系進行了遺傳多樣性分析。結果表明，在256個試驗品系中共檢測到271個等位基因，每個標記的多態性片段的均值為4.52個，其變異范圍在1～8，PIC值為0.41;256個品系遺傳相似系數在0.32～1，平均相似系數為0.59，其中40.4%的遺傳相似系數>0.6，說明這些供試品系親緣關系較近。研究結果將為水稻品種遺傳多樣性的鑒定以及水稻育種的遺傳改良提供科學依據。

關鍵詞：水稻品系;遺傳多樣性;SSR標記;聚類分析

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030009

農作物種質資源是保障農業生產穩定的基礎，也是人類未來生存和發展的先決條件，其在農業科學和生命科學研究領域中占有極為重要的地位[1]。在生物體的長期進化中，基因突變和重組導致了自然有性生殖的2個個體后代產生與親本不相同的基因型，如何鑒別后代在外觀與親本類似的情況下是否產生這種遺傳變異是值得研究的問題。物種的種質資源遺傳多樣性可以用來發現和用于改良現有品種以及創新新種質。水稻、小麥和玉米是中國3種主要糧食作物，我國超過1/2的人口以大米為主食，江蘇省的氣候、地理環境適宜水稻生長，也是我國水稻主要分布地區之一，江蘇省水稻品種遺傳多樣性的調查和了解對于優質水稻品種選育具有積極作用。

對植物品種特異性、一致性和穩定性測試是保護新品種的技術基礎和科學依據[2，3]，該測試主要在于田間種植鑒定，根據品種田間表型差異來判定新品種是否有別于親代[4]，但周期長、容易受到環境影響、工作量大等。隨著新品種數量的增多，該測試技術已經難以在實踐中進行，鑒定結果嚴重滯后，甚至會對執法效率產生嚴重影響[5]。而DNA指紋圖譜技術的出現解決了這一難題，指紋圖譜技術是基于DNA分子標記鑒別生物個體差異的DNA電泳圖譜，主要包括基于AFLP、RFLP、RAPD、SSR、SNP等標記的指紋技術[6]，具有多態性高、特異性強并且能夠穩定遺傳等特點，其中SSR和SNP標記最為常用。SSR標記是由Tautz等[7]提出，技術優點有操作簡單、重復性好、共顯性[8];在短時期內，農作物進行品種鑒定的主要方法就是采用SSR標記法。研究結果可以了解DNA水平上種質之間的遺傳關系并表現出基因型差異。將DNA指紋檢測技術應用于作物DUS測試實踐，有助于規范種業市場，對保護我國豐富的種質和基因資源、保障我國農業生產及糧食安全具有重要意義。

遺傳多樣性研究是種質資源工作的基礎，也是遺傳演化研究和育種的理論基礎，對于發掘控制重要農藝性狀相關基因以及育種實踐均具有較強的參考價值和指導意義[9]。本研究采用60個對江蘇水稻品種具有良好特異性的SSR分子標記，分析了2019年江蘇省水稻聯合體供試的269份品系的遺傳多樣性。研究結果對江蘇省水稻參試品系之間的遺傳多樣性得以更深入地了解，為以后水稻育種中的親本材料的選配提供參考依據。

1 試驗材料和方法

1.1 材料

試驗材料是2019年江蘇省水稻聯合體試驗參試品系，來自11個聯合體19組試驗，根據試驗生態類型劃分，可分為以下試驗組：早熟晚粳組49份，中熟中粳組103份，遲熟中粳組117份，共計269份。其中，10個品系區試生試同步（同名品系2個樣品），3個品系有食味品嘗樣品（同名品系參試）。分子標記用《江蘇水稻品種真實性鑒定SSR標記法》中對江蘇水稻品種特異性較好的60個SSR標記。

1.2 方法

1.2.1 秧苗栽插管理

試驗在揚州大學實驗農牧場進行，2019年5月5日播種，1個月后將培育好的水稻秧苗移栽至大田，單株栽插，每個品系栽插4行，每行12株，共48株。秧苗成長期間田間正常進行病蟲害的防治及肥水管理。

1.2.2 DNA的提取

水稻秧苗移栽大田14d后，用CTAB法提取葉片基因組DNA。剪取各品種隨機種植的幼嫩葉片提取總DNA。

1.2.3 PCR擴增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR是用于放大擴增特定DNA片段的分子技術，PCR擴增反應體系為DNA（20ng·μL-1）2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol·L-1MgCl22μL，10μmol·L-1前引物0.4μL，10μmol·L-1后引0.4μL，10mmol·L-1dNTPs0.4μL，5U·μL-1Taq酶0.2μL。PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性30～45s，50～60℃退火45s，72℃延伸30s，72℃延伸8min，10℃保溫30min，35個循環。

PCR擴增產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離檢測（150V、200A），電泳結束后采用硝酸銀染色7min，蒸餾水漂洗2次，顯影液顯色至帶型清晰，用雙蒸水沖洗2遍，瀝干，封膠，拍攝成像，最后讀膠并進行賦值。

1.3 數據統計分析

按照“0、1”賦值法[10]將膠進行賦值，供試品系的標記對比標準帶型在相同位置上有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，并做好數據記錄工作，計算生物多態信息含量[11]：

PICi=1∑ni=1p2ij

式中，pij表示標記i的第j個等位基因在群體中的分布頻率，標記i的總等位基因數從j=1～n。運用R語言計算269個參試品系兩兩間的遺傳相似系數，利用遺傳相似系數矩陣，用最小離差平方和法進行聚類分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 269份參試品系在60對SSR引物下的多態性分析

用60對SSR引物對269份參試品系進行PCR擴增，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，圖1所示為以RM1195引物擴增的部分參試品系的電泳檢測結果，參試品系前是一個Marker作為標記，以方便對比片段大小，并且加入了引物所對應的標樣（參照品種）以檢測參試品系和標樣之間是否有差別。

采用上述方式，用60對SSR引物分別對269個參試品系進行檢測，269個參試樣品中，13個同名品系DNA指紋相同，農藝性狀考察表型也一致，說明本試驗檢測結果準確。整理好數據后，將檢測出的等位基因數與多態性信息含量（PIC）進行計算和統計（見表1）（由于269個檢測樣品中有13個是同名品系，后續計算、表述均基于256個樣品）。在256份參試品系中共檢測到271個等位基因，每個標記多態性片段的均值是4.52個，其變異范圍在1～8個，其中2～7個的多態性片段占據比例為91.7%，表明60對SSR引物在參試品系中有較好多態性。

多態性信息含量是反映被測品系之間SSR標記變異程度和SSR標記效率的指標，檢測到等位基因數量越多，PIC值越大，或等位基因頻率越高，PIC值越大;反之，PIC值越小。PIC值>0.5，多態性較高;0.25≤PIC值≤0.5，多態性適中;PIC值<0.25，多態性較低[12]。對60對引物的PIC值進行了計算和統計（見表1）。結果表明，參試的256個品系的平均PIC值為0.41，變化范圍在0～0.76。引物RM274僅檢測到1個等位基因，PIC為0;引物RM21檢測到9個等位基因，PIC為0.76。有45個SSR標記的PIC值≥0.25，占75%;有25個SSR標記的PIC值>0.50，占42%。進一步說明這60個SSR標記在參試品系中具有良好多態性。

2.2 遺傳相似性分析

遺傳相似性系數用來表示2個品種間的親緣關系的遠近，數值越高，親緣關系越近;反之，則越遠。利用60對SSR標記位點上256個品系的分配信息，使用R語言進一步估算了256個品系之間的相互遺傳相似性系數，256個參試品系相互遺傳相似性系數介于0.32～1，平均0.59，相互遺傳相似性系數在0.6以上的占比40.4%，說明這些品系總體來說親緣關系較近。其中有3組品系，遺傳相似系數為1，說明其盡管名稱不同，實質是同一個品系;親緣關系較遠的2個品系是“保豐805”和“鎮稻9503”，之間的遺傳相似系數僅0.32。部分參試品系間的遺傳相似系數見表2。

利用遺傳相似系數矩陣進行聚類分析（見圖2），發現以生育期為主劃分的同一生態類型品種（根據試驗組別確定）并沒有被更多聚在一起的跡象，說明品系之間的親緣關系與生育期并不密切，更多的可能還是與品系育成單位的親本選配有關。

3 小結與討論

利用在江蘇水稻品種特異性較好的60個SSR標記對2019年江蘇的256份水稻品系進行遺傳多樣性分析，結果表明，參試的256個品系的平均PIC值為0.41;有45個SSR標記的PIC值≥0.25，占比75%;有25個SSR標記的PIC值>0.50，占比42%;進一步說明這60個SSR標記在參試品系中多態性良好。參試品系的平均遺傳相似性系數為0.59，遺傳相似性系數在0.6以上的占比40.4%，說明這些品系總體來說親緣關系較近。其中也發現極端類型的3組品系，遺傳相似系數為1，實質是同質不同名品系參試。

從對256份材料研究結果表明，江蘇省水稻新品系間的遺傳多樣性可能并不豐富，遠距離地區之間的基因交流和優良基因的挖掘仍然有待提高。因此，在未來育種工作中，育種工作者仍需多多收集其它水稻品種豐富地區的優良種質資源，增加引進外來品種，掌握所選親本的遺傳多樣性，創新育種方法，培育優質水稻品種。

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（責任編輯 周康）