響應面法優化臭靈丹中異綠原酸B的提取工藝研究

李玉蓉 彭誠 柳絲瑤 單亮

【摘 ? 要】 為了優化臭靈丹中異綠原酸B的提取工藝，在前期單因素試驗對功率、時間、料液比、乙醇濃度四個影響提取因素比較的基礎上，應用HPLC法測定含量，通過Box-Behnken實驗對數據進行了響應面法分析。結果得出：異綠原酸B的最佳提取工藝為超聲功率300w，超聲時間51minn，料液比38：1 g/mL，乙醇濃度為74%，其得率為1.598%。

【關鍵詞】 臭靈丹草;異綠原酸B;HPLC響應曲線法

中圖分類號：R284.2 ? ? ? ? ? ? 文獻識別碼：A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2096-1073（2020）10-0034-36

[Abstract] In order to optimize the extraction process of iso-chlorogenic acid B from Odorant panacea， on the basis of the comparison of four factors affecting the extraction， namely power， time， solid-liquid ratio and ethanol concentration， HPLC method was used to determine the content， and response surface method was used to analyze the data through box-Behnken experiment. The results showed that the optimal extraction technology of iso-chlorogenic acid B was ultrasonic power 300w， ultrasonic time 51minn， solid-liquid ratio 38：1 g/mL， ethanol concentration of 74%， and yield of 1.598%.

[Key words] panacea purpurea; isochlorogenic acid B; HPLC response curve method

臭靈丹草，學名（Laggera pterodonta），在民間被稱為臭葉子、大黑藥等，為菊科翼齒六棱菊的全草，洗凈后干燥入藥。它是云貴川地區常見的中草藥，其味苦、辛，性寒，具有非常高的藥用價值，近年來逐漸應用于臨床中，可治療急性呼吸道感染、感冒和甲型H1N1流感等，對治療多類病毒有明顯功效。據相關研究發現，水提物中的二咖啡酰奎尼酸結構對單純皰疹病毒Ⅰ型，單純皰疹病毒Ⅱ型以及流感病毒ⅣA所致的細胞病變有抑制作用[1]。因此，探究臭靈丹中二咖啡酰奎尼酸的含量和功效具有重大意義，該試驗主要針對臭靈丹中異綠原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）的提取工藝進行研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

臭靈丹草采于云南省石林彝族自治縣周邊;異綠原酸B標準品由成都曼思特公司購買;實驗所需儀器、用具、試劑、藥品等均由吉林農業科技學院制藥工程實驗室提供。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 HPLC化合物含量測定 ?HPLC條件：型號為Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）;流動相為0.1%乙酸水（A）-甲醇（B）洗脫梯度 （0～5min，20%～35%B，5～13min，35%～50%B， 13～18min，50%～80%B，8～40min，80%～20%B），檢測波長327 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進樣量20 μL。

標準品的制備：在弱光線的環境下，分別取10mL棕色瓶放入標準品B 3.7 mg，加100%甲醇溶解并定容，制成每1mL含0.37mg的異綠原酸B溶液，置于2-8℃下待用。

供試品的配置：將臭靈丹粉末過40目篩，稱取全草粉末1.000 g放入錐形瓶，倒入甲醇溶液至刻度線，準確稱重，在功率300w、頻率50kHz條件下，對藥材進行超聲處理1h，冷卻后補充缺少重量，備用。

1.2.2 線性回歸方程 ?標準品溶液移入25mL容量瓶中，分別加入甲醇溶液稀釋至2、4、6、8、10 倍，定容后根據1.2.1方法進樣測定峰面積，得出異綠原酸B的線性關系為：Y=97164440X-2184，線性范圍0.02～0.10 mg/mL，R2=0.9998。

1.2.3 響應面因素水平設計 ?通過該試驗前期階段的單因素試驗考察結果，選擇出條件較好的三個水平，借助Box-Benhnken模型建立與分析四項因素，設計響應面試驗因素及水平，見表1。

2 ?結果與分析

2.1 ?異綠原酸B的方差分析

借助Box-Benhnken模型，對異綠原酸B提取試驗進行了Box-Behnken設計，針對結果分析得出響應面模型的回歸方程：

Y1 =+1.558-7.75A+0.1001B+0.0332C-0.014D+0.0202AB+0.1307AC+0.0437AD+0.0425BC-0.0297BD-0.052CD-0.1259A2-0.1113B2-0.1412C2-0.1568D2

異綠原酸B的方差分析結果見表2。

由表2可得出，衡量控制組與實驗組差異大小的P值小于0.01，Fb=22.15，表明模型擬合方程顯著，根據兩模型失擬項的方差分析，P>0.05，Fb=3.337，失擬項不顯著，實驗數值之間差異小，方程式可以完全反映實驗的實際情況。試驗所選模型的決定系數R2=0.9668，變異系數（C V%）=3.13，表明其擬合程度良好，測試誤差較小，模型可用來分析與預測異綠原酸B的提取率，得出最佳超聲功率300w、最佳提取時間51min、最佳料液比為38：1（g/mL）、最佳乙醇濃度為74%。

2.2 ?交互作用分析

異綠原酸B的交互影響見如圖1。由圖1的3D圖可知響應面曲面的傾斜程度確定兩者對響應面值的影響程度，說明兩者之間的交互作用，AC（功率與料液比）的曲面傾斜的坡度最抖，表示功率與料液比的交互作用最顯著;而圖AB（提取時間與濃度）的曲面傾斜的坡度最緩，則提取時間與濃度的交互作用影響較小。

3 ?結論

本試驗是建立在前期超聲提取臭靈丹草中異綠原酸B單因素試驗基礎上，通過優化實驗數據后，選擇四因素中的三水平進行解析，根據 Box-Behnken設計，提取出異綠原酸B的成分，通過數據分析可知，異綠原酸B最佳提取條件為：最佳超聲功率300w、最佳提取時間51min、最佳料液比為38：1（g/mL）、最佳乙醇濃度為74%;在所選因素范圍內提取影響順序為：提取乙醇濃度>料液比 >提取功率>提取時間。該試驗可為臭靈丹草中的異綠原酸B提取工藝進行優化提供參考，也對該中藥的二次開發研究提供了實驗基礎及科學的實驗依據。

參考文獻：

[1] 王胤驍.云南民間常用藥臭靈丹的研究概述[J].云南中醫中藥 ? ? ? 雜志，2019（07）.

[2] 韓永成.金銀花藥材質量綜合評價研究[J].中國優秀碩士學位 ? ? ?論文全文數據庫，2014（01）.

[3] 朱雪飛.固態發酵法制備苜蓿肽的工藝及其理化特性研究[J]. ? ? ?中國優秀碩士學士論文全文數據庫，2015（05）.

（編輯：赫亮）