羽衣甘藍花青素的定位及含量成分測定

王玉書 趙 爽 張 琳 崔劍英 王紫薇 曲美卓瑪 高巖松 辛喜鳳

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.河北省保定市農產品質量監督管理站，河北 保定 071000)

羽衣甘藍(BrassicaoleraceaL. var.acephala; 2n=18)為十字花科蕓薹屬甘藍種的變種。由于其多變的葉形和多彩的葉色，已經成為重要的園林綠化植物。作為蔬菜，其富含的維生素、礦物質及一些生物活性物質，又具有重要的營養價值[1]。

高等植物呈現出豐富多變的顏色取決于天然植物色素的存在，包括葉綠素(chlorophyll)、類黃酮(flavonoids)、類胡蘿卜素(carotenoids)和甜菜色素(betalains)等，不同種類植物積累色素不同因而表現為不同的顏色。紫色、紅色、粉色和玫紅等葉色的羽衣甘藍中含有豐富的花青素[2]。花青素作為類黃酮類化合物，廣泛存在于植物的葉、花和果實等器官中。它既能賦予植物絢麗的顏色，又可以提高植物自身的光保護、抗旱、抗凍、抗病和抗氧化等能力[3-4]。除此之外，花青素具有抗炎、抗腫瘤、防衰老、降糖、降脂和預防心血管疾病等多重保健功效[5-8]。植物中最常見的花青素包括天竺葵素、矢車菊素、飛燕草素、芍藥素、矮牽牛素和錦葵素6種色素，不同的花青素會呈現出不同的顏色。花青素通常以糖基化的形式存在，同時這些糖苷經常被芳香酸和脂肪酸酰基化，如香豆素、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、丙二酸和蘋果酸等[9]。花青素成分及含量的差異直接影響植物各器官顏色的呈現，因此對花青素分布及成分含量研究具有重要意義。

目前，關于羽衣甘藍花青素特性的研究鮮有報道。本研究利用徒手切片法制片在光學顯微鏡下觀察花青素在羽衣甘藍莖葉中的分布情況，測定紫葉羽衣甘藍葉片中花青素含量，同時通過HPLC-MS技術鑒定紫葉羽衣甘藍心葉中所含花青素的成分，旨在明確羽衣甘藍植株體內花青素的分布、種類及含量情況，以期為羽衣甘藍花青素的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取紫葉和白葉2個不同羽衣甘藍純系‘D07’和‘D06’(圖1)，于2019 年盆栽種植于齊齊哈爾大學實驗基地，長至蓮座期后分別置于10 ℃/6 ℃和20 ℃/6 ℃(日溫/夜溫)生長15 d，于觀賞期取樣試驗。

圖1 紫葉(a)和白葉(b)羽衣甘藍DH系Fig.1 The purple (a) and white (b) leaf pure lines of kale

1.2 切片制作

將新鮮的羽衣甘藍葉片和莖段洗凈并泡在蒸餾水中濕潤備用，用雙面刀片沿著植物材料切口平行切下，切下后將刀片上的植物組織輕輕轉移至盛有蒸餾水的培養皿中，用鑷子輕輕取出切面完整、薄厚均勻的組織制成臨時裝片。置于光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 花青素相對含量測定

花青素測定方法參考鄺敏杰等[10]的方法。取 2 g 新鮮葉片，加入30 mL提取液(0.1 mol/L HCl和95%乙醇體積比為l∶1)，60 ℃水浴1 h，浸提1次，4 ℃，5 000 r/min離心15 min，過濾。取花青素提取液1 mL，分別加入2 mL、pH 1.0的KCl緩沖液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液，振蕩搖勻，于520 和700 nm下測吸光值，重復3次。總花青素含量計算公式如下:

式中：C，花青素含量，mg/g；A，pH 1.0和pH 4.5緩沖液光密度值的差值；V，提取液總體積，mL；n，稀釋倍數；M，矢車菊-3-葡糖苷的相對分子質量，449.2；ε，矢車菊-3-葡糖苷的消光系數(26 900)；m，樣品質量，g。

1.4 花青素成分分析

提取花青素濾液經轉濃縮，后經孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣分析，利用HPLC-MS液質聯用分析儀檢測花青素成分。

色譜條件：色譜柱選用 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。流動相A為乙腈，B為0.1%三氟乙酸，梯度洗脫程序：0～5 min，A 為 40%；5～7 min，A 為40%～70%；7～10 min，A 為 70%；10～11 min，A 為 100%；11～12 min A 為 40%，流速為 0.3 mL/ min，進樣量2 μL，柱溫為 30 ℃。

質譜條件：正離子模式，自動二級質譜掃描，掃描范圍(質荷比)200～2 000，毛細管電壓3 000 V，離子源溫度為 300 ℃，干燥氣溫度為 350 ℃，干燥氣流量為 600 L/h。

1.5 統計與分析

本研究使用Excel 軟件統計數據，然后用Xcalibur軟件分析花青素的質譜流圖、一級質譜圖、二級質譜碎片離子峰和綜合保留時間，根據一級質譜的分子離子信息和二級質譜碎片離子，并結合相關文獻[11-13]對各個色譜峰進行結構推斷，鑒定羽衣甘藍花青素的主要成分。

2 結果與分析

2.1 羽衣甘藍花青素的組織定位

分別取植株心葉、外葉和莖，采用徒手切片法制成臨時裝片，在光學顯微鏡下直接觀察花青素在紫葉羽衣甘藍‘D07’和白葉羽衣甘藍‘D06’中的分布。

由圖2可知，紫葉羽衣甘藍‘D07’心葉上下表皮鄰近處均有一定花青素細胞分布，集中積累于上表皮下部2層葉肉細胞和下表皮上部的4層葉肉細胞中，其外觀表現為整個心葉呈現紫色(圖2(a))；而外葉中花青素集中分布在上表皮下部的1層葉肉細胞和下表皮上部2層葉肉細胞中(圖2(b))，紫色層的數量在上部和下部都有所減少，表現為部分葉片呈紫色或葉脈呈紫色。在白葉羽衣甘藍‘D06’的心葉(圖2(c))和外葉(圖2(d))中均未觀察到花青素類物質的存在。

由圖3可知，紫葉羽衣甘藍上部莖、中部莖以及靠近基部的莖中都有花青素存在，集中積累于表皮細胞及表皮下2～4層薄壁細胞，在維管組織的韌皮部細胞中并沒有發現花青素分布，整個莖外部表現為越靠近上部花青素分布越少(圖3(a))，越靠近基部花青素積累的越多(圖3(b))，紫色的程度越深。在白葉羽衣甘藍‘D06’的莖(圖3(c))中同樣未觀察到花青素類物質的存在。

綜上，高濃度的花青素在組織中積累賦予了羽衣甘藍華麗的紫色。綠葉白心羽衣甘藍由于綠色葉綠素層存在而表現出莖和外葉均為綠色，白色心葉的呈現推測與入射光線在葉肉細胞間隙反復折射有關[14]。

比例尺為200 μm。The scale bar is 200 μm.圖3 ‘D07’和‘D06’莖橫切面Fig.3 Transverse section of stem in ‘D07’ and ‘D06’

2.2 溫度對紫葉羽衣甘藍花青素含量的影響

由圖4可知，在20 ℃時，‘D07’心葉、外葉的花青素含量為0.255和0.013 mg/g，而10 ℃條件下生長，心葉和外葉的花青素含量為0.411和0.079 mg/g。結果表明，紫葉羽衣甘藍‘D07’在 10 ℃ 環境下，整株葉片(心葉和外葉)中花青素含量均高于20 ℃條件中生長的葉片，可見低溫對于花青素的合成有一定的促進作用。另外，在10和 20 ℃ 溫度中生長，‘D07’心葉花青素含量均高于外葉，說明花青素在植株中的分布具有發育時期特異性。

圖4 不同溫度對羽衣甘藍‘D07’心葉和外葉花青素含量的影響Fig.4 Effects of different temperatures on anthocyanin contents in inner and outer leaves of ‘D07’

2.3 紫葉羽衣甘藍中花青素成分分析

本研究中，利用 HPLC-MS 技術對紫葉羽衣甘藍心葉樣品的花青素進行定性鑒定，該樣品中共檢測出38個高低不同的特征峰。這些特征峰的保留時間集中在 8～20 min。

由表1可知，在紫葉羽衣甘藍‘D07’中共鑒定出矢車菊素和飛燕草素2大類花青素共9種花青素苷，分別為矢車菊素-3-葡萄糖-5-葡糖苷、矢車菊-3-槐糖-5-葡糖苷、矢車菊素-3-槐糖(對香豆酰)-5-葡糖苷、矢車菊素-3-槐糖(咖啡酰)-5-葡糖苷、矢車菊素-3-槐糖(阿魏酰)-5-葡糖苷、矢車菊素-3-槐糖(草酸酰-對羥基苯甲酰)-5-葡糖苷、矢車菊素-3-槐糖(芥子酰)-5-葡糖苷、飛燕草-3-葡糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖(咖啡酰)-5-葡糖苷，這些花青素的二級質荷比分別為287和303。然而，樣品中并沒有鑒定出二級質荷比分別為 301、317、331 和 271 的芍藥色素、矮牽牛素、錦葵色素和天竺葵色素。紫葉羽衣甘藍‘D07’的花青素主要以高度糖基化和酰基化的花青素苷為主，而且 77%以上的花青素都屬于矢車菊素類衍生物。

表1 HPLC-MS 鑒定紫葉羽衣甘藍中花青素的主要成分Table 1 Composition of anthocyanins in purple leaf kale identified by HPLC-MS analysis

表1(續)

表1(續)

3 討 論

不同植物花青素在植株中定位存在一定的差異。非洲菊(GerberajamesoniiBolu)花瓣中花青素主要定位于柵欄組織，只有很少量分布于上下表皮[7]；而彩葉草中含有的花青素則集中積累于葉片上表皮細胞內[8]；紫葉突變甘藍型油菜(Brassicanapus)的花青素分布在呈色的葉面表皮細胞層，花青素分布密度隨著葉色變淺也隨之降低[15]。即使在蕓薹屬植物之間其組織分布特征也有所不同。紫甘藍、紫色蕪菁葉片中花青素苷集中分布于表皮細胞[16]；紫色白菜葉片的花青素僅分布于上表皮細胞[17]；紫色花椰菜幼葉表皮下的細胞是花青素苷主要分布區[18]；而紫心大白菜葉片表皮細胞及表皮鄰近的葉肉細胞中均有花青素分布[19]。

本研究中，紫葉羽衣甘藍外葉和心葉中花青素主要分布于上表皮下的1～2層葉肉細胞和下表皮上的2～4層葉肉細胞中，表皮細胞中并未觀察到花青素的存在，與紫色花椰菜花青素的組織分布特征一致，而莖中花青素的分布特征與紫心大白菜葉片中花青素分布特征類似，集中積累于表皮細胞及表皮下2～4層薄壁細胞。不同材料中存在的分布差異可能與花青素的合成機制和貯運方式有關。

蕓薹屬植物中花青素被鑒定出來的種類越來越多，紫色不結球小白菜(BrassicarapaL. ssp.chinensis)中就有20種左右的花青素被鑒定出來，以矢車菊素-3-槐糖(丙二酰)-5-阿拉伯糖(對羥基苯甲酰)和矢車菊素-3-蕓香糖(芥子酰化的咖啡酰)-5葡萄糖為主[20]；而在紫色花椰菜(BrassicaoleraceaL. var.botrytis)中鑒定出以矢車菊素-3-槐糖(對香豆酰)-5-葡萄糖為主要成分的約10 種花青素[21]；紫色芥藍 (Brassicajunceavar.tumidaTsen et Lee)中的花青素以矢車菊素-3-槐糖(芥子酰化阿魏酰)-5-葡萄糖(丙二酰)和矢車菊素-3-槐糖(阿魏酰)-5-葡萄糖(丙二酰)2種花青苷含量居多[22]；Zhu等[23]研究報道在羽衣甘藍中鑒定出8種花青素成分，其中矢車菊素-3-雙糖(芥子酰阿魏酰)-5-葡萄糖含量最高，其次是矢車菊素-3-雙糖(芥子酰)-5-葡萄糖。以上研究中鑒定出的花青素大部分以矢車菊素為主。本研究從紫葉羽衣甘藍純系中檢測到9種花青素組分，以矢車菊素為主，幾種主要成分均為矢車菊-3-槐糖-5-葡糖苷中3號位被不同有機酸酰基化的衍生物，此外還含有飛燕草-3-葡糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖(咖啡酰)-5-葡糖苷2種飛燕草素成分。