鑒定動物奶源的多重RCR方法建立及應用

王天添 劉 悅 趙 遠 王艷雙 李明成，3 孫麗媛*

(1.北華大學 醫學技術學院， 吉林 吉林132013；2.北華大學 醫學院， 吉林 吉林 132013；3.吉林省中藥DNA指紋檢測技術科技創新中心，吉林 吉林132013)

據《中國統計年鑒2018》數據顯示，我國奶制品產出量位居世界前五。作為高蛋白、高營養且易于被人體吸收的飲用品之一，奶產品深受大眾歡迎。近年來，除牛奶外，羊奶、馬奶、駱駝奶等特色奶也逐漸進入大眾視野。受產出量[1]、稀有度以及營養價值不同的影響[2-8]，不同奶制品差價顯著。不法商家借由對特色奶功效盲目吹捧，導致牛奶及各特色奶間價格差異不斷增大[9-11]，并以低價奶、水、甚至偽乳蛋白摻假至高價奶中售賣，不僅侵犯消費者權益，也對國民身體健康造成嚴重威脅[12-13]。

針對動物奶源的研究多集中于相同奶制品中不同添加劑的檢測及2種/3種奶源種屬相近樣品間檢測[14-22]。未見成體系的牛奶與特色奶間的鑒別方法，無法一次性實現對各奶樣的鑒別檢測。多重PCR技術又稱多重引物PCR或復合PCR技術，具有高效性、系統性及經濟簡便性等優點，可同時檢測多種DNA，便于實行快速檢測。本研究旨在建立一種多重PCR檢測體系，對常見的5種液態奶(牛奶、山羊奶、綿羊奶、馬奶和駱駝奶)進行鑒別，為我國奶制品市場監管提供便利。

1 材料與儀器

1.1 試驗樣品與試劑

牛奶、山羊奶、綿羊奶標準品奶樣采自當地牧場，馬奶、駱駝奶標準品奶樣采自新疆南山牧場。24份混合奶樣由標準品奶樣等比例混合而成(具體可見2.4.4)。市售樣品10份(牛奶5份，羊奶1份，山羊奶1份，馬奶2份，駱駝奶1份)，購自當地超市以及線上銷售處。

100 bp DNA Marker、50 bp DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix、組織/細胞/血液基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；引物Bos-157、Cap-133、Ovi-80、Equ-188和Cam-113由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器設備

TC9600-G多功能梯度PCR儀(美國Labnet公司)、JY300E通用型電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀 (美國Biorad公司)、NanoDropOne微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)、YXQ-LS-75S11立式蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司)、Thermo Fisher高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 試驗方法

2.1 奶制品 DNA提取

量取待測奶樣約2 mL，分別置于干凈Ep管中，7 000 r/min 離心3 min；棄去上層脂質層與中間層液體，400 μL PBS 溶液反復沖洗沉淀，7 000 r/min 離心3 min；棄去上層脂質層與中間層液體，加入400 μL體積比為酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的提取液，用移液槍反復吹吸，渦旋振蕩至完全混合，12 000 r/min 離心5 min；棄去下層有機溶劑，加入400 μL 氯仿溶液，移液槍反復吹吸，振蕩，12 000 r/min 離心5 min；棄去下層有機溶劑，余下步驟參照天根細胞基因組提取試劑盒說明書。

NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀，1 μL上樣測量。

2.2 設計特異性引物

GenBank中選取各動物線粒體基因序列為靶基因序列：牛(序列ID：KU291093.1)、山羊(序列ID：LT560065.1)、綿羊(序列ID：KU146454.1)、馬(序列ID：LT560065.1)、駱駝(序列ID：KU146454.1)，NCBI Primer-Blast設計相應特異性引物(表1)。

表1 特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers

2.3 PCR反應

單重PCR反應體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物 F和R(10 ng/μL)各0.5 μL，DNA 模板(10 ng/μL) 1 μL，無菌ddH2O補足至20 μL。反應參數：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

五重PCR反應體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；Bos-157(1.55 μmmol/L)、Cap-133(2.0 μmmol/L)、Ovi-80(10.0 μmmol/L)、Equ-188(10.0 μmmol/L)、Cam-113(10.0 μmmol/L)；每一物種DNA 模板(10 ng/μL)0.5 μL，共計2.5 μL；無菌ddH2O補足至30 μL。反應參數：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30 個循環；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

PCR 產物檢測：1.5%～2% 瓊脂糖凝膠，100 V/cm 電泳60～100 min。紫外分析儀觀察。

2.4 方法學評價

2.4.1引物特異性評價

以常見物種DNA(牛、山羊、綿羊、馬、駱駝、驢、大豆和核桃)作為模板，分別以Bos-157、Cap-133、Ovi-80、Equ-188和Cam-113作為引物，按單重PCR反應體系、反應參數進行擴增，分析每對引物特異性。ddH2O作為陰性對照模板。1.5%瓊脂糖凝膠，100 V/cm電泳60 min。紫外分析儀觀察。

2.4.2多重PCR反應體系特異性評價

以1為遞減數量依次減少體系中模板DNA物種數，按2.3中五重PCR反應體系、反應參數進行擴增，分析多重PCR反應體系特異性。ddH2O作為陰性對照模板。2% 瓊脂糖凝膠，100 V/cm 電泳100 min。

2.4.3多重PCR反應體系靈敏性評價

提取標準品奶樣DNA，ddH2O梯度稀釋，終濃度為10～10-5ng/μL。參照2.3中五重PCR反應體系，保持其中4種模板濃度不變，改變剩余物種模板濃度，相同反應參數進行PCR擴增。根據電泳結果分析多重PCR反應體系靈敏度。

2.4.4混合奶樣檢測

取標準品奶樣，均等混合制備混合奶樣：4種奶源奶樣混合(1∶1∶1∶1)、3種奶源奶樣混合(1∶1∶1)、2種奶源奶樣混合(1∶1)，共計24份混合奶樣。參照2.1方法提取DNA,五重PCR反應體系進行擴增。2% 瓊脂糖凝膠，100 V/cm 電泳100 min。紫外分析儀觀察。

隨機抽取其中5份混合奶樣DNA，對本檢測體系做重復性評價。

2.5 市售奶制品檢測

按照2.1方法提取10份市售樣品DNA，NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀測定準確濃度，稀釋至10 ng/μL。按照2.3中五重PCR反應體系擴增。2% 瓊脂糖凝膠，100 V/cm 電泳100 min。

3 結果

3.1 奶制品 DNA提取

2.1方法提取奶樣DNA，微量核酸蛋白測定儀測定，純度均處于1.70～2.10，質量濃度均不低于100 ng/μL(表2)，證明本研究所建立奶制品DNA提取方法可有效提取奶樣DNA，市售加工奶制品提取效率稍次于標準品，但皆可滿足后續PCR要求。

表2 奶樣DNA濃度及純度檢測Table 2 Concentration and purity of samples DNA

3.2 特異性檢測

如圖1(a)～(e)所示，各物種引物特異性試驗中分別僅在牛、山羊、綿羊、馬、駱駝處見單一特異條帶，其他泳道皆無條帶擴增，表明本研究所設計引物具有良好特異性。

如圖1(f)所示，1～5號泳道依次見牛/山羊/綿羊/馬/駱駝；牛/山羊/綿羊/馬；牛/山羊/綿羊；牛/山羊；牛特異性條帶。初步表明本研究所建立五重PCR反應體系特異性良好。

M,100 bp DNA Ladder；N,空白對照.(a)～(e): 1,牛；2,山羊；3,綿羊；4,馬；5,駱駝；6,驢；7,大豆；8,核桃.(f): 1,牛/山羊/綿羊/馬/駱駝；2,牛/山羊/綿羊/馬；3,牛/山羊/綿羊；4,牛/山羊；5,牛M, 100 bp DNA Ladder; N, negative control. (a)-(e): 1, cow; 2, goat; 3, sheep; 4, horse; 5, camel; 6, donkey; 7, soybean; 8, walnut. (f): 1, cow/goat/sheep/horse/camel/donkey; 2, cow/goat/sheep/horse/camel; 3, cow/goat/sheep; 4, cow/goat; 5, cow圖1 引物特異性檢測Fig.1 Specific tests of primers

3.3 靈敏性檢測

如圖2(a)～(e)所示,調節5種動物奶源模板DNA濃度，使其中任一模板濃度梯度遞減，其余4種模板濃度保持不變。最佳多重PCR反應條件進行擴增檢測，牛、山羊、綿羊、馬、駱駝最低檢測限均可達到1 ng/μL，其他4種特異條帶亮度不受影響。表明本研究所建立多重PCR檢測體系結果穩定，當任意一種DNA減少至1 ng/μL時，仍可準確檢測，且無交叉干擾。

M, 100 bp DNA Ladder； 1, 10 ng/μl； 2, 1 ng/μl； 3, 10-1 ng/μl； 4, 10-2 ng/μl； 5, 10-3ng/μl； 6, 10-4ng/μl； 7, 10-5 ng/μl； N, 空白對照Note: M, 100 bp DNA Ladder; 1, 10 ng/μl; 2, 1 ng/μl; 3, 10-1 ng/μl; 4, 10-2 ng/μl; 5, 10-3 ng/μl; 6, 10-4 ng/μl; 7, 10-5ng/μl; N, Negative control圖2 多重PCR檢測體系靈敏性檢測Fig.2 Sensitivity test of multiplex PCR detection system

3.4 混合奶樣檢測

人工模擬均等混合奶樣檢測，5種標準品奶樣均等混合檢測結果作為陽性對照，顯示5條特異性條帶；無模板檢測結果為陰性對照，對應泳道無條帶。圖3為10份2種奶樣均等混合、10份3種奶樣均等混合和4份4種奶樣均等混合檢測結果，各泳道僅出現特異性條帶，所有條帶清晰明亮。試驗結果表明本五重PCR檢測體系可基本滿足動物奶源實際摻假情況檢測。

M,50 bp DNA Ladder；P,陽性對照；N,空白對照.(a): 1,牛/山羊；2,牛/綿羊；3,牛/馬；4,牛/駱駝；5,山羊/綿羊；6,山羊/馬；7,山羊/駱駝；8,綿羊/馬；9,綿羊/駱駝；10,馬/駱駝；11,牛/山羊/綿羊；12,牛/山羊/馬 (b): 1,牛/山羊/駱駝；2,牛/綿羊/馬；3,牛/綿羊/駱駝；4,牛/馬/駱駝；5,山羊 -綿羊/馬；6,山羊/綿羊/駱駝；7,山羊/馬/駱駝；8,綿羊/馬/駱駝；9,牛/山羊/綿羊/馬；10,牛/山羊/綿羊/駱駝；11,山羊/綿羊/馬/駱駝；12,牛/綿羊/馬/駱駝M, 50 bp DNA Ladder; P, Positive control; N, Negative control. (a): 1, cow/goat; 2, cow/sheep; 3, cow/horse; 4, cow/camel; 5, goat/sheep; 6, goat/horse; 7, goat/camel; 8, sheep/horse; 9, sheep/camel; 10, horse/camel; 11, cow/goat/sheep; 12, cow/goat/horse (b): 1,cow/goat/camel; 2, cow/sheep/horse; 3, cow/sheep/camel; 4, cow/horse/camel; 5, goat/sheep/horse; 6, goat/sheep/camel; 7, goat/horse/camel; 8, sheep/horse- camel; 9, cow/goat/sheep/horse; 10, cow/goat/sheep/camel; 11, goat/sheep/horse/camel; 12, cow/sheep/horse/camel圖3 混合奶樣檢測Fig.3 Detection of mixed milk samples

3.5 市售樣本檢測

10份奶樣中，5份牛奶試樣僅檢測出牛源性特異性目的條帶，2份羊奶試樣中除了檢出羊源性條帶，皆檢出牛源性條帶，說明有牛奶摻入，2份馬奶、1份駱駝奶中均只檢出相應的馬與駱駝源性成分，未見摻假其他動物源性成分的情況(圖4)。

M,50 bp DNA Ladder；P,陽性對照；1,牛奶；2,牛奶；3,牛奶；4,牛奶；5,牛奶；6,羊奶；7,山羊奶；8,馬奶；9,馬奶；10,駱駝奶；N,空白對照M, 50 bp DNA Ladder; P, positive control; 1, milk; 2, milk; 3, milk; 4, milk; 5, milk; 6, goat milk; 7, goat milk; 8, horse milk; 9, horse milk; 10, camel milk; N, negative control圖4 市售樣品檢測Fig.4 Testing of commercially available samples

4 討 論

中國奶文化傳承數千年，奶產品在日新月異的今天儼然已經成為廣大民眾的生活必需品。不同動物奶的產出率、營養價值及受歡迎程度等差異使奶產品間差價愈發顯著。駱駝奶、馬奶等高價奶受不完善產業鏈的影響，產出率較牛奶低。不法商家為謀求利益，擾亂奶制品市場，恣意出售摻假高價奶，嚴重侵犯消費者權益。良好的產品質量監管既是中國奶業快速發展的必需條件，也是保障消費者權益的重要前提。目前，奶產品摻假鑒定方法主要通過不同奶制品營養成分的差異(蛋白質、脂肪、DNA分子和β-胡蘿卜素等)作為切入口，對奶產品做質量分析[15-19]。

尹艷[19]應用SDS-PK法區分駱駝奶與豆漿，PCR方法對牛奶、羊奶、水牛奶、駱駝奶和豆奶進行鑒別，酶切鑒別牛奶、水牛奶與耗牛奶，并進一步建立熒光定量PCR方法對牛奶進行定量分析。雖然可以對牛奶及常見奶制品進行簡單鑒別，但檢測一種樣品需多次PCR驗證，試劑耗損嚴重，檢測時間長，不適合廣泛應用于市場上奶制品監管檢測。杜文博[20]根據揮發物質的不同應用氣相色譜-離子遷移譜對牛奶粉、羊奶粉及摻假羊奶粉進行鑒別，但此方法并不適用于多種液態奶間鑒別。陳筱婷[21]針對牛奶、羊奶、豆奶建立了三重熒光PCR檢測體系，實現了牛、羊奶間摻假鑒別。范陽陽等[22]通過多重PCR檢測體系檢測羊奶中牛、大豆源性成分。未見牛奶、山羊奶、綿羊奶、馬奶及駱駝奶間完好鑒定體系。

本研究基于多重PCR技術，建立針對牛奶、山羊奶、綿羊奶、馬奶及駱駝奶的多重PCR檢測體系，動物奶源DNA含量低至檢測樣品總DNA含量2.4%時，仍可準確檢測。檢測靈敏度高，重復性好，充分保證檢測準確性；無需大型精密檢測儀器，耗費較少；應用最常見的瓊脂糖凝膠電泳即可對結果進行分析。一次檢測即可鑒定常見奶源DNA摻假情況，良好特異性引物的選擇，避免了假陽性的出現，在條件允許時，可進一步對樣品PCR產物進行測序分析，對檢測結果做進一步驗證。高準確性、低成本的特點為市場奶產品摻假檢測提供便利基礎，適用于奶類市場質控監測。未來可考慮將本研究成果與側向流技術聯用，將檢測體系試紙條化，實現現場即時檢測；也可通過熒光定量PCR技術，建立多重熒光定量檢測體系，進一步分析待測樣品中動物奶源DNA含量。