宮頸癌患者外周血小核仁RNA宿主基因1表達及臨床意義

陳琳，趙松蘭，左亞敏，曹杰

鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院婦產科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病機制涉及病毒感染、營養(yǎng)不良、環(huán)境污染等多種因素，而進一步的深入研究發(fā)現，宮頸癌的發(fā)病機制復雜，常伴有原癌基因或抑癌基因的調控異常[1]。長鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200 nt的非編碼RNA，可通過表觀調控染色質沉默、調控轉錄、競爭性結合微小RNA（microRNA，miRNA）調控靶基因表達等途徑而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2-3]。小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）是由內含子編碼的U22小核仁RNA（intron-encoded U22 small nucleolar RNA，UHG）轉錄而來的長鏈非編碼RNA，位于11號染色體[4-5]。已有研究報道，SNHG1異常表達與多種腫瘤密切相關，如神經膠質瘤、食道癌、胃癌等，其表達異常可能與腫瘤患者的生存和預后有關[6-10]，但關于SNHG1在宮頸癌中表達的研究相對較少。因此，本研究擬通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測和分析SNHG1在宮頸癌中的表達，及其與患者預后的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2011年5月至2018年9月鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院收治的56例宮頸癌患者，作為宮頸癌組。納入標準：均經病理學活檢確診為宮頸癌。排除標準：合并其他惡性腫瘤；1個月內曾經有輸血史。56例宮頸癌患者，年齡37～78歲，平均（58.54±8.46）歲；年齡＞45歲26例，≤45歲30例；體重指數（body mass index，BMI）19.59～26.04 kg/m2，平 均（22.76±4.79）kg/m2；合并人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染30例，未合并HPV感染26例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期31例；分化程度：低分化21例，中分化15例，高分化20例；病理類型：鱗狀細胞癌39例，非鱗狀細胞癌17例；腫瘤大小：≥4 cm 26例，＜4 cm 30例；淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移30例；術后復發(fā)29例，術后無復發(fā)27例。隨機同期選取在本院進行健康體檢的30例健康者作為對照組，年齡36～75歲，平均（57.56±7.36）歲；BMI為 19.92～26.37 kg/m2，平均（21.86±5.24）kg/m2。兩組受試者年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準通過，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。收集上述宮頸癌患者和對照組受試者的靜脈血，同時取56例宮頸癌患者的宮頸癌組織及其相應的癌旁組織，保存待檢。

1.2 定量RT-PCR法檢測SNHG1mRNA的相對表達量

宮頸癌患者于入院次日清晨，對照組受試者于體檢當日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝處理，1000 r/min離心5 min后，除去上清，采用1 ml的Trizol吹勻細胞沉淀，參照Trizol法提取總RNA后，經隨機六聚體引物法逆轉錄合成cDNA。手術切除的宮頸癌組織和癌旁組織離體后及時轉運至液氮保存，研磨獲取細胞，再參照上述Trizol法提取總RNA并進行逆轉錄合成cDNA。RT-PCR法進行擴增，反應體積 20 μl，包含 AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，SNHG1上下游引物各 0.8 μl，雙蒸水 6 μl，cDNA 2 μl。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s；58℃退火30 s；反應條件：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60℃15 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，采用2-△△Ct法計算SNHG1mRNA的相對表達量。SNHG1上游引物：5'-TGGTGAAGGAATGGGACA-3'，下游引物 ：5'-CAAGCAGGTTATTGGTTAGT-3'；GAPDH上游引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3'，下游引物：5'-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3'。

1.3 隨訪方法

根據初診時留取的患者聯系方式，每個月通過電話的方式直接向患者或其家屬了解患者的病情和生存情況。若隨訪時患者仍存活，則記錄下隨訪時間；若隨訪時患者已死亡，則記錄患者的具體死亡時間和死因。從患者出院后第1個月開始至隨訪截止時間（2018年9月），每月電話隨訪1次，直至患者死亡。在隨訪患者無病生存信息時，有7例患者無法獲取其準確的疾病復發(fā)及死亡時間，因此，未納入無病生存分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統(tǒng)計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗；以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under curve，AUC）評估SNHG1的表達對宮頸癌的診斷價值；不同組間變量的相關性采用Spearman相關分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SNHG1mRNA 相對表達量的比較

宮頸癌患者外周血SNHG1mRNA相對表達量為0.675（0.312，1.700），明顯高于對照組受試者的0.136（0.016，0.373），差異有統(tǒng)計學意義（U=276.000，P＜0.01）。宮頸癌患者宮頸癌組織中SNHG1mRNA相對表達量為0.869（0.419，1.992），明顯高于癌旁組織的0.122（0.024，0.299），差異有統(tǒng)計學意義（U=177.000，P＜0.01）。

2.2 SNHG1表達與宮頸癌的診斷效能

ROC曲線結果顯示，SNHG1表達診斷宮頸癌的AUC為0.836（95%CI：0.748～0.924），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 SNHG1表達診斷宮頸癌的ROC曲線

2.3 不同臨床特征宮頸癌患者外周血中SNHG1表達情況的比較

以外周血SNHG1mRNA相對表達量0.551為界，SNHG1高表達宮頸癌患者30例，SNHG1低表達宮頸癌患者26例。不同年齡、HPV感染情況、分化程度、病理類型和腫瘤大小宮頸癌患者外周血中SNHG1表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和術后無復發(fā)的宮頸癌患者外周血中SNHG1呈低表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.4 相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，宮頸癌患者外周血SNHG1的表達與宮頸癌組織中SNHG1的表達呈正相關（r=0.785，P＜0.01）。

2.5 預后情況的比較

SNHG1高表達宮頸癌患者的總生存時間為17.83（9.18，25.35）個月，明顯短于SNHG1低表達患者的31.11（24.28，39.85）個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.854，P=0.002）（圖2）。SNHG1高表達患者的無病生存時間為14.83（8.30，22.31）個月，與SNHG1低表達患者的27.27（15.39，40.18）個月比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.354，P=0.245）。

3 討論

越來越多的研究證實，SNHG1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。既往研究報道顯示，SN-HG1在結腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、非小細胞肺癌、肝癌等多數實體瘤中發(fā)揮促癌分子作用[9-13]，其分子機制主要通過競爭性吸附miRNA，從而上調癌性編碼基因，形成腫瘤[9,11-12]。此外，SNHG1還可通過直接靶向調控特異性的信號通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。與上述基礎研究不同，本研究主要探討SNHG1在宮頸癌外周血中的表達，結果顯示，宮頸癌患者外周血中SNHG1的表達上調，這與SNHG1在其他的腫瘤中表達上調一致。此外，Liu等[14]檢測宮頸癌組織和細胞系中SNHG1呈高表達，并敲低SNHG1的表達后，宮頸癌細胞HeLa和C-33A的增殖、遷移及侵襲能力均降低。以上結果均表明，SNHG1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演促癌基因的作用，但仍需體外機制研究及體內試驗進一步證實SNHG1的功能。

表1 不同臨床特征宮頸癌患者SNHG1表達情況的比較

圖2 SNHG1高表達（n=30）與SNHG1低表達（n=26）宮頸癌患者的總生存曲線

此外，本研究結果發(fā)現，SNHG1可能作為潛在的分子標志物輔助宮頸癌的診斷和預后，ROC曲線分析發(fā)現，SNHG1輔助診斷宮頸癌的靈敏度和特異度均較高，且SNHG1的表達與宮頸癌患者的預后也密切相關。同樣，多項研究發(fā)現，SNHG1過表達常提示預后不良，可能作為潛在的分子標志物對腫瘤診斷、預后判斷發(fā)揮重要作用[15-17]。本研究發(fā)現，SNHG1高表達可能與較高的淋巴結轉移率和術后復發(fā)率有關，這也為患者的不良預后提供了一定的理論依據。

除檢測外周血中SNHG1的表達外，本研究還檢測了宮頸癌組織和癌旁組織中SNHG1的表達情況，結果顯示，宮頸癌患者外周血中SNHG1的表達與宮頸癌組織呈正相關。與病理組織的檢測相比，具有創(chuàng)傷小、易獲得的特點，表明外周血中的SNHG1可能是代替腫瘤組織的潛在新型腫瘤標志物。這也為后續(xù)宮頸癌患者的療效評估提供了一種便捷可能性，具有較為實際的臨床應用價值。

綜上所述，宮頸癌患者外周血SNHG1的表達上調，是宮頸癌輔助診斷及預后評估的潛在分子標志物。