第二個源于線粒體的胱天蛋白酶激活因子在胃癌組織中的表達情況及與患者臨床特征和預后的關系△

李艷菊，劉小星，梁珊珊，冉彩虹，南達卓瑪

1延安大學附屬醫院病理科，陜西 延安 716000

2西藏自治區阿里地區人民醫院檢驗科，西藏 阿里地區 859000

胃癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，具有病死率高、易轉移、預后差等特點，嚴重威脅人們的生命健康[1]。目前，胃癌的治療以手術切除聯合放化療為主，但術后淋巴結轉移率較高，患者預后較差。研究顯示，胃癌患者的5年生存率僅為25%左右[2]。研究胃癌的發生及發展機制、從分子水平上預測疾病的發展趨勢、選擇新的治療靶點在胃癌的治療中具有重要意義[3]。研究顯示，腫瘤細胞存在明顯的凋亡異常現象，細胞凋亡缺陷已成為惡性腫瘤的研究重點[4]。第二個源于線粒體的胱天蛋白酶激活因子（second mitochondria-derived activator of caspase，Smac）是細胞凋亡過程中的重要誘導基因，其在腫瘤的發生及發展中均發揮重要作用[5]。本研究探討了Smac在胃癌組織中的表達情況，并分析其與患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年12月至2015年12月于延安大學附屬醫院接受手術治療的胃癌患者。納入標準：經術后病理檢查確診為胃癌；臨床資料完整；具有病理組織標本。排除標準：術前接受過放化療。依據納入和排除標準，本研究共納入72例患者。其中，男45例，女27例；年齡26～77歲；腫瘤位置：賁門32例，胃體21例，胃竇19例；腫瘤分化程度：高分化14例，中分化16例，低分化24例，未分化18例；有淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移29例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期29例，Ⅳ期21例。收集患者的胃癌組織標本72例及正常胃組織標本30例，其中正常胃組織為距離腫瘤病灶邊緣5 cm以上并經病理證實無腫瘤細胞的切緣組織。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用免疫組織化學染色鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測Smac在胃癌組織及正常胃組織中的表達情況。石蠟切片常規脫水后進行抗原修復，采用H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，封閉非特異性位點；滴加一抗，4℃孵育過夜；置于室溫，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后滴加生物素標記的二抗，37℃溫箱內孵育35 min；PBS沖洗后滴加SP復合物，37℃溫箱內孵育30 min；PBS沖洗，二甲基聯苯胺顯色5 min；自來水沖洗，蘇木素復染10 min；自來水沖洗10 min，鹽酸酒精分化2～3 s；自來水沖洗，溫水浸泡返藍30 min；脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5 min；中性樹脂封片。采用已知的Smac陽性表達的乳腺癌切片作為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學染色結果判定

Smac陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒狀。由兩名病理醫師采用雙盲法對切片進行觀察，每張切片隨機選擇10個高倍視野（×400），每個高倍視野計數100個細胞。采用半定量積分法判斷Smac的表達情況。依據染色強度評分：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞＜5%為0分，5%≤陽性細胞＜25%為1分，25%≤陽性細胞＜50%為2分，陽性細胞≥50%為3分。染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++），其中弱陽性（+）、中等陽性（++）及強陽性（+++）均為陽性。

1.4 觀察指標

比較胃癌組織和正常胃組織中Smac的表達情況，比較不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中Smac的表達情況。隨訪3年，統計胃癌患者的生存情況，比較胃癌組織中Smac陽性表達和陰性表達患者的生存率。根據隨訪情況，將患者分為生存組與死亡組，比較兩組患者胃癌組織中Smac的表達情況。分析胃癌組織中Smac表達情況與胃癌患者臨床特征及預后的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Spearman等級相關分析進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和正常胃組織中Smac表達情況的比較

Smac陽性染色主要位于細胞質，陽性細胞呈棕黃色或黃色。胃癌組織中Smac的陽性表達率為56.94%（41/72），低于正常胃組織的 90.00%（27/30），差異有統計學意義（χ2=10.413，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中Smac表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、浸潤深度胃癌患者胃癌組織中Smac的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。高/中分化、無淋巴結轉移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者胃癌組織中Smac的陽性表達率分別高于低/未分化、有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中Smac表達情況的比較（n=72）

2.3 生存情況的比較

胃癌組織中Smac陽性表達患者的3年生存率為60.98%（25/41），高于Smac陰性表達患者的32.26%（10/31），差異有統計學意義（χ2=4.621，P＜0.05）。（圖1）

圖1 Smac陽性表達（n=41）和Smac陰性表達（n=31）胃癌患者的生存曲線

2.4 生存組和死亡組患者胃癌組織中Smac陽性表達率的比較

術后3年，35例患者生存，37例患者死亡，3年生存率為48.61%。生存組胃癌患者胃癌組織中Smac的陽性表達率為71.43%（25/35），高于死亡組的43.24%（16/37），差異有統計學意義（χ2=5.83，P＜0.05）。

2.5Smac 表達情況與胃癌患者臨床特征及預后的相關性

相關性分析結果顯示，胃癌組織中Smac陽性表達與腫瘤分化程度及患者預后均呈正相關（r=0.41、0.36，P＜0.05），與淋巴結轉移及TNM分期均呈負相關（r=-0.44、-0.46，P＜0.05）。

3 討論

發展中國家胃癌的發病率較高，據統計，中國每年新發胃癌病例高達40萬，而胃癌治療后的復發率及轉移率極高，患者預后較差[6-7]。胃癌的發生及發展與凋亡基因調控相關，了解基因產物在信號通路中的作用對闡明發病機制、制訂腫瘤靶向治療方案具有積極意義。

細胞凋亡在維持機體內環境穩定，調節生物存活周期、衰老、死亡等生理過程中發揮重要功效，其是一種由多種因子介導的細胞主動死亡的過程[8-10]。細胞凋亡主要通過3條通路實現，即死亡受體通路、線粒體通路及內質網通路，3條通路間又通過各種凋亡細胞因子相互作用而緊密相連[11-12]。胱天蛋白酶（caspase）家族是執行凋亡的關鍵酶，caspase的級聯活化是細胞凋亡的主要環節[13-15]。Smac基因位于第12條染色體長臂，由7個外顯子組成，是除了細胞色素C以外被認識的第2種線粒體促凋亡蛋白，成熟的Smac分子含有184個氨基酸，存在于線粒體中，Smac在正常細胞中不會誘導凋亡，但在化學或物理凋亡信號的刺激下，將與細胞色素C一同被釋放至細胞質，由于Smac N端具有線粒體定位信號，能夠解除凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的凋亡抑制作用，Smac主要通過caspase 3的水解作用和增強成熟caspase 3的酶催化活性兩個途徑促進細胞凋亡[16-17]。成爭艷等[18]研究發現，食管癌患者中Smac的表達水平明顯降低，且Smac類似物能夠有效增強食管癌患者的治療效果。以上研究提示Smac可能與惡性腫瘤的發生及發展存在密切聯系。

Smac在人體各組織中普遍存在，在心、肝、腎、脾、前列腺及卵巢組織中的陽性表達率較高。本研究結果顯示，與正常胃組織相比，胃癌組織中Smac的陽性表達率較低；同時，腫瘤分化程度低、有淋巴結轉移、TNM分期較晚的胃癌患者胃癌組織中Smac的陽性表達率較低。提示Smac低表達可能使細胞凋亡減少，導致凋亡與增殖失衡，進而促進腫瘤細胞生長，加速病情發展。陳雷和尚培中[19]的研究發現，Smac低表達可抑制腫瘤細胞凋亡，降低化療藥物對腫瘤細胞的敏感性，與本研究結果一致。

本研究對所有患者隨訪3年，其中35例患者生存，3年生存率為48.61%（35/72）。經分析發現，胃癌組織中Smac陽性表達患者的生存率高于Smac陰性表達患者，生存組患者胃癌組織中Smac的陽性表達率高于死亡組，提示胃癌組織中Smac的表達情況與患者預后具有一定的聯系。此外，相關性分析結果顯示，胃癌組織中Smac陽性表達與腫瘤分化程度及患者預后均呈正相關，與淋巴結轉移及TNM分期均呈負相關，與習舉云和熊小勇[20]的研究結果一致。然而本研究的樣本量較小，未能深入研究其他凋亡基因與Smac的關系，未能全面系統地分析胃癌發生發展與細胞增殖、凋亡機制的聯系，有待于加大樣本量進一步研究。

綜上所述，胃癌組織中Smac的陽性表達率低于正常胃組織，且TNM分期晚、腫瘤分化程度低、有淋巴結轉移的胃癌患者胃癌組織中Smac的陽性表達率較低，胃癌組織中Smac陽性表達與腫瘤分化程度及預后均呈正相關，與淋巴結轉移及TNM分期均呈負相關。