重組人血管內(nèi)皮抑制素抑制P 糖蛋白表達對晚期非小細胞肺癌耐藥性的影響△

程少先，譚詩云

華中科技大學(xué)協(xié)和京山醫(yī)院1胸外科，2神經(jīng)內(nèi)科，湖北 京山 431800

肺癌是當今人類發(fā)病率最高的惡性腫瘤，居腫瘤死因第一位，給世界帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%，其標準治療方案是手術(shù)切除和術(shù)后放化療，目前NSCLC患者術(shù)后化療的有效率為30%～40%，并且大約有一半的NSCLC患者初次發(fā)現(xiàn)時已是中晚期（Ⅲ期及以上），無法進行手術(shù)切除，因此化療在肺癌患者尤其是中晚期患者中起到關(guān)鍵作用[2]。但是由于經(jīng)驗性用藥[3-5]和化療過程中腫瘤細胞產(chǎn)生的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）[6]，化療效果往往并不顯著。MDR的產(chǎn)生最根本的原因之一是細胞膜表面P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）轉(zhuǎn)運體過表達[7]。國外諸多的研究結(jié)果顯示，藥敏實驗可作為研究腫瘤化療臨床療效的有效方式，且腫瘤細胞體外化療藥敏實驗結(jié)果與體內(nèi)化療療效符合率高達80%以上[8-10]。目前，對于奈達鉑和重組人血管內(nèi)皮抑制素的體外耐藥實驗研究較少，有待于進一步研究。本研究回顧性分析92例NSCLC合并惡性胸腔積液患者的臨床資料，應(yīng)用MTT藥敏實驗檢測重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合奈達鉑作用后肺組織中淋巴細胞P-gp陽性表達率，探討重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合奈達鉑治療NSCLC對耐藥性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年11月至2019年11月華中科技大學(xué)協(xié)和京山醫(yī)院收治的NSCLC合并惡性胸腔積液患者的病歷資料。納入標準：①病理組織學(xué)或活檢確診為NSCLC，臨床分期為ⅢB～Ⅳ期；②彩超及X線檢查確診為惡性胸腔積液；③未發(fā)現(xiàn)根治性手術(shù)指征且生存期＞3個月。排除標準：①合并心功能異常或肝腎功能障礙；②合并免疫性疾病、凝血功能障礙及全身感染性疾病；③有化療禁忌證；④存在嚴重肺部疾病病史或既往有化療史；⑤納入研究前1個月有手術(shù)史或外傷史；⑥腫瘤細胞已侵襲重要血管或發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。根據(jù)納入、排除標準，共納入92例NSCLC合并惡性胸腔積液患者，其中男性45例，女性47例，中位年齡56.43歲，所有患者收治前均經(jīng)過3～6個療程的全身化療。收集92例患者無變性、無壞死的新鮮NSCLC組織，分為對照組與觀察組，每組46例。

1.2 儀器與試劑

FACScan型流式細胞檢測儀購自美國Becton Dickinson公司；P-gp試劑與試劑盒均購自法國國際免疫公司。

1.3 實驗方法

對照組予奈達鉑培養(yǎng)48 h，觀察組予奈達鉑培養(yǎng)24 h后繼續(xù)重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液培養(yǎng)24 h。比較兩組患者處理前后的P-gp表達情況。抗癌藥物濃度根據(jù)臨床化療用藥劑量，按下列公式計算：實驗用藥物濃度 P（mg/L）=50×D/5000÷50%×103[D為臨床用藥劑量（mg·kg-1·d-1）]。

應(yīng)用FACScan型流式細胞檢測儀對兩組患者的淋巴細胞標本進行檢測（每份標本收集20 000個淋巴細胞），應(yīng)用Cell Ques Plot軟件在Macintosh 650型電腦上進行數(shù)據(jù)分析。P-gp的含量以P-gp陽性細胞所占百分比表示，P-gp含量=陽性細胞數(shù)/（陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù)）-非特異性結(jié)合細胞；P-gp陽性界值通過對患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量的測定進行結(jié)算，測定患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量后取95%可信區(qū)間上限，即均值+2×標準差為陽性的界值，大于該陽性界值可判定為P-gp表達陽性，小于或者等于該陽性界值可判定為P-gp表達陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前，兩組患者P-gp陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，觀察組患者P-gp陽性表達率下降，對照組P-gp陽性表達率上升，且觀察組患者P-gp陽性表達率低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 治療前后兩組患者P-gp陽性表達率的比較

3 討論

在中國肺癌已經(jīng)成為威脅人民健康和生活質(zhì)量最主要的惡性腫瘤，其5年生存率約為10%，影響肺癌患者生存率的主要因素是MDR導(dǎo)致的化療失敗。惡性腫瘤的耐藥機制通常較為復(fù)雜，目前國內(nèi)外對于惡性腫瘤耐藥機制的研究較多，尤其是與P-gp相關(guān)的研究[11]。于云莉等[12]指出P-gp屬于能量依賴性外排泵，能夠?qū)⒂H脂型藥物泵出細胞外。有學(xué)者在研究中指出，當藥物進入細胞之后，P-gp作為MDR1編碼的細胞膜糖蛋白會與藥物分子結(jié)合，同時P-gp的ATP位點會在結(jié)合ATP之后釋放出能量使藥物轉(zhuǎn)移到細胞外，進而導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度始終保持在低水平，造成耐藥性的產(chǎn)生[13-14]。本研究顯示入組標本治療前已經(jīng)有較高的P-gp陽性表達率，并且兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明NSCLC合并胸腔積液患者MDR具有普遍性，這也反映了肺癌患者總體5年生存率低的原因。

Huang等[15]亦指出，P-gp除了能夠以能量依賴性的方式將藥物泵出細胞外，減少藥物進入細胞的概率和細胞內(nèi)積蓄藥物的量，還能夠讓細胞內(nèi)藥物再分布，起到減少作用靶點部位藥物濃度的作用。因此，NSCLC患者肺癌組織中P-gp的陽性表達能夠促進NSCLC組織耐藥性的形成，除此之外，P-gp還能夠通過對凋亡關(guān)鍵酶的抑制作用直接抑制細胞的凋亡，但P-gp和信號分子之間的關(guān)系較為復(fù)雜，其確切的耐藥機制尚有待于進一步研究[16]。

重組人血管內(nèi)皮抑制素能夠通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子受體促進血管內(nèi)皮細胞凋亡，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的效率[17]。相關(guān)的基礎(chǔ)研究顯示，重組人血管內(nèi)皮抑制素能夠通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的分泌，抑制血管內(nèi)皮生長因子的活性，從而抑制腫瘤淋巴管及血管的生成，降低腫瘤血管的通透性，減少胸腔積液的生成[18]。在重組人血管內(nèi)皮抑制素的抗腫瘤機制方面，Liang等[19]的研究指出，重組人血管內(nèi)皮抑制素可以通過促血管生成因子和抗血管生成因子之間平衡的重建實現(xiàn)對腫瘤血管正常化的誘導(dǎo)，起到抗腫瘤的作用。近年來國外諸多的研究者致力于通過抑制血管內(nèi)皮生長因子與血管內(nèi)皮生長因子受體的結(jié)合抑制新生血管的生成，進而實現(xiàn)抑制腫瘤生長的目的[20-21]。抗新生血管生成藥物和化療藥物協(xié)同作用能夠阻斷腫瘤的營養(yǎng)供給，降低腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能。由于血管內(nèi)皮細胞具有遺傳上的穩(wěn)定性，因此在應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑制素治療惡性腫瘤時不易獲得耐藥性。但由于該類藥物具有非細胞毒性和靶向性等特點，主要對腫瘤細胞起到穩(wěn)定和調(diào)控的作用，不容易達到最大耐受劑量，因此通常在臨床中與常規(guī)的放化療聯(lián)合應(yīng)用或序貫應(yīng)用。本研究中觀察組聯(lián)合應(yīng)用奈達鉑和重組人血管內(nèi)皮抑制素后P-gp陽性表達率下降。

董米連等[22]研究顯示外周血淋巴細胞可以代替大腸癌細胞進行體外藥敏實驗。覃理靈等[23]利用肝癌患者淋巴細胞與腫瘤細胞進行化療藥物敏感測定顯示，肝癌患者淋巴細胞化療藥敏檢測對不可切除的肝癌選擇化療藥物具有重要參考價值。由于本研究所選病例均為晚期患者，標本量有限，其研究P-gp陽性界值是通過對患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量的測定進行結(jié)算，所以選擇淋巴細胞進行P-gp蛋白測定而不是選擇腫瘤細胞測定，結(jié)果顯示淋巴細胞代替腫瘤細胞進行體外藥敏實驗是可行的。

本研究應(yīng)用MTT藥敏實驗對NSCLC患者不同個體進行化療藥物篩選可以幫助患者克服耐藥性，提高生存率，有著重要的研究價值，對于NSCLC合并惡性胸腔積液患者的藥物選擇和個性化治療有著重要的意義。