HPLC法測定梔子中梔子苷含量的不確定度分析*

廖夫生，韋國兵，熊 魏

(江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004)

梔子是我國首批藥食兩用中藥材，目前主要產于江西、湖南、四川等地，是江西道地藥材之一。梔子具有抗炎鎮痛、保肝利膽等作用，同時對神經系統和心腦血管疾病也有一定治療作用。梔子中主要含有梔子苷、西紅花素、梔子酸等成分，現代藥理研究表明，梔子中主要藥理成分為梔子苷。2020版中國藥典中，采用HPLC法測定了梔子中梔子苷的含量[1]。

但在測量過程中，往往存在各種因素使得測定結果不準確，因此分析測量不確定度是評價測定方法的重要指標，也決定了測量結果的實用價值，不確定度越小，使用價值越大[2-4]。本文以梔子苷含量測定為例，對HPLC法含量測定不確定度評價進行分析，找出此法不確定度產生的主要因素，建立HPLC外標法不確定度的通用模型，對HPLC法不確定度的評價有一定意義。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

1260Agilent HPLC儀；色譜柱Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm)；AB104-N分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 材 料

梔子、梔子苷對照品(批號：1107499-200714，>98.0%)，中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱: Eclipse XDB-C18(250 mm×416 mm，5 μm)； 流動相：乙腈-水(15:85)，流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：238 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取的對照品梔子苷16.24 mg，置25 mL容量瓶中，加15 mL甲醇超聲溶解后，稀釋至刻度，搖勻，即得梔子苷對照品儲備液。精密量取梔子對照品儲備液2 mL至25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。制成濃度51.968 μg/mL的梔子苷對照品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，測定5次，峰面積分別為：599.1，602.7，592.3，605.4，596.0。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取0.5 g梔子粉末，精密加入25 mL無水甲醇，稱重，超聲提取30 min，補重，過濾，精密量取2 mL續濾液至25 mL的容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，供試品溶液。分別測定5次，峰面積分別為：543.6，550.1，553.4，548.9，592.6。

2.4 樣品測定

量取對照品溶液和供試品溶液20 μL，分別進樣，測定，按外標一點法進行計算，結果梔子中梔子苷的含量為2.98%。

3 不確定度分析[5-6]

3.1 數學模型

3.2 分析不確定度來源

依據數學模型可知，供試品含量測定結果的誤差主要來源于mi、As、Vs、Vi、ms、Ai六個分量。進一步分析可知實驗整個過程的誤差主要來源于2個方面：峰面積測定的不確定度和濃度的不確定度。但在分析每一個不確定度時應該考慮其每一個影響因素。

4 不確定度分量的計算

4.1 對照品純度的不確定度u(pi)

4.2 質量類不確定度(mi，ms)

4.2.1 對照品稱質量的相對不確定度u(ms)

主要有2個來源，包括電子天平稱量值的不確定度u(ms1)和電子天平重復性代入的不確定度u(ms2)：1級電子天平的允許誤差為±0.1 mg，按正態分布計算u(mi1)=0.1/3=0.033 mg：1級電子天平允許的RSD為0.05 mg。由于對照品梔子苷取樣量為16.24 mg，則相對標準不確定度為:

4.2.2 樣品質量的不確定度u(mi)

同樣來源于電子天平稱量值的不確定度u(mi1)和稱量天平重復性代入的不確定度u(mi2)，梔子取樣量為0.4997 g，則相對標準不確定度為：

因此質量類引入的不確定度：

4.3 體積類不確定度(Vs、Vi)

4.3.1 配制對照品溶液時引入的體積不確定度u(Vs)

同樣可知5 mL移液管u(Vs2)：

u(Vs22)=0.008 mL

因此，對照品合成標準相對不確定度為：

4.3.2 樣品稀釋時引入的體積不確定度

樣品稀釋時使用了50 mL量瓶、5 mL移液管，采用4.3.1方法分別對這些玻璃儀器的不確定度u(Vi)進行分析，50 mL量瓶的不確定為：

5 mL移液管u(Vi2)的不確定度為:

u(Vi22)=0.016 mL

因此，樣品稀釋引起的相對不確定度為：

4.4 峰面積類不確定度(AS，Ai)

4.4.1 對照品的峰面積不確定度u(As)

4.4.2 樣品測得的峰面積的相對不確定度u(Ai)

因此由峰面積類引入的不確定度為：

4.5 不確定度的合成與評價

4.5.1 合成標準不確定度

4.5.2 擴展不確定度

取包含因子k=2，則梔子苷的擴展不確定度

Ur(S)=2.98%×0.0058×2=0.035%

5 結 論

采用HPLC對梔子苷含量進行測定時，對測定結果影響因素很多，難以一一評估，對已評估的幾個主要影響不確定度因素中，對照品純度為0.577%，質量類為0.380%，體積類為0.4248%，峰面積類為0.999%，峰面積引入的不確定度最大。而峰面積引入的不確定主要和儀器的精密度有關，儀器的精密度越好，重復性越高，不確定度越小，結果越準確。因此，在測定過程中。增加進樣次數、采用自動進樣，可減少進樣誤差，提高進樣的精密度和重復性。