UPLC-MS-MS法測定原料藥中對甲苯磺酸酯類遺傳毒性雜質*

勾新磊，徐雙雙，趙 婷，張 梅，劉偉麗，高 峽，趙新穎，胡光輝

(北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室， 北京 100089)

硫酸氫氯吡格雷是一種具有抑制血小板聚集作用的藥物，臨床上主要用于預防或者治療中風及心肌梗死、外周動脈疾病等心血管系統疾病[1-3]。硫酸氫氯吡格雷的合成方法中會使用到對甲苯磺酰氯，若沒有在工藝中完全除去，會與后面使用的甲醇或乙醇發生反應，生成對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯[4]。對甲苯磺酸酯類物質均具有潛在的遺傳毒性，與人體的DNA有直接作用，導致DNA的損傷，會產生致癌、致畸或致突變等后果，因此有必要建立硫酸氫氯吡格雷中對甲苯磺酸酯類物質的檢測方法。

目前報道的檢測方法主要有液相色譜法，氣相色譜質譜聯用法，液相色譜質譜聯用法等[5-8]。液相色譜質譜聯用技術具有分析速度快、靈敏度高、結果準確可靠的特點，能夠滿足遺傳毒性雜質的檢測[9]。本文建立了硫酸氫氯吡格雷中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)檢測方法，為硫酸氫氯吡格雷在生產監控過程中提供技術支持和數據支撐。

1 儀器與耗材

超高效液相色譜串聯質譜儀，美國沃特世公司； Milli-Q 超純水器，美國Millipore公司； XPE105電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，沃特世公司。

對甲苯磺酸甲酯(純度>99.7%)、對甲苯磺酸乙酯(純度>99.8%)，均購于Alfa Aesar；乙腈、甲酸均為色譜級，默克公司；硫酸氫氯吡格雷原料藥。

2 方法與結果

2.1 色譜質譜條件

2.1.1 質譜條件

采用電噴霧正離子化(ESI+)測定2個遺傳毒性雜質，優化后的參數如下：毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔氣流速20 L/h，萃取電壓：5.0 V。多反應監測(MRM)模式檢測，實驗參數見表1。

表1 雜質的質譜條件

2.1.2 色譜條件

液相色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈溶液為流動相B；梯度洗脫(0～4 min，20%B → 80% B；4～6 min，80% B； 6～6.5 min，80%B → 20% B；6.5～8 min，20% B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL。總離子流圖見圖1。

圖1 對甲苯磺酸甲酯(A)和對甲苯磺酸乙酯(B) 對照品溶液總離子流圖

2.2 溶液配制

2.2.1 雜質對照溶液配制

分別準確稱取適量上述2種雜質標準品，乙腈溶解定容，制得質量濃度均為1000 mg/L 的儲備液。準確移取各標準儲備液，混于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成目標物濃度為1 mg/L 混合對照品儲備液。所有標準溶液在4 ℃下保存。

2.2.2 供試品溶液

取硫酸氫氯吡格雷原料藥約100 mg，置于10 mL 量瓶中，加入乙腈10 mL溶解，并稀釋至刻度，搖勻均勻，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

在所建立的色譜和質譜條件下，2種遺傳毒性雜質的保留時間分別為4.20和4.55 min，2種物質完全分離。供試品溶液、空白稀釋劑和雜質對照溶液中各雜質的檢查無干擾。

2.4 檢測限和定量限

取2種雜質對照品儲備液，稀釋至各雜質峰高約為基線噪音的10 倍，測得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的定量限濃度均為5.0 ng·mL-1。連續進樣6 次，對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD 分別為2.4%和1.8%，表明定量限具有一定的精密度。

取定量限溶液，稀釋后進樣測定至各雜質峰高約為基線噪音的3 倍，測得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的檢測限濃度為1.667 ng·mL-1。

2.5 標準曲線

精密量取“2.2.1”項下雜質混合溶液適量，稀釋后制成各雜質的質量濃度均分別約為20、50、100和200 ng·mL-1的系列溶液，與定量限溶液參照“2.1”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度X(ng·mL-1)為橫坐標，主峰面積Y 為縱坐標，進行線性回歸。對甲苯磺酸甲酯線性回歸方程分別為Y=72.6X+68.4，r=0.997；對甲苯磺酸甲酯線性回歸方程分別為Y=101.5X+83.1，r=0.998。結果表明，各雜質線性關系良好。

2.6 回收率試驗

取硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品各9份，每份約100 mg，分別置于10mL容量瓶中，精密加入雜質混合溶液，稀釋至刻度，配置80 ng·mL-1、100 ng·mL-1、120 ng·mL-13個濃度的供試品溶液各3份，進樣分析，根據“2.5”項下線性方程計算，對甲苯磺酸甲酯的平均回收率分別為94.1%～100.5%，RSD分別為1.7%～3.7%，對甲苯磺酸乙酯的平均回收率分別為96.9%～105.3%，RSD分別為2.1%～4.4%，所以本方法回收率良好。

2.7 進樣精密度和重復性試驗

取“2.2.1”項下雜質對照溶液，連續進樣6 次，計算得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為1.7%、1.9%，表明進樣精密度良好。

取硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，樣品均未檢出雜質；另配制含雜質均約為100 ng·mL-1的供試品溶液6 份，進樣測定，計算得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為2.1%和1.8%，表明方法重復性良好。

2.8 樣品檢測

取3 批硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品，按外標法計算硫酸氫氯吡格雷中雜質的含量。結果顯示，3 批樣品中均未檢出對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯。

3 結 論

本方法經方法學試驗驗證，方法專屬強，靈敏度高，能夠滿足硫酸氫氯吡格雷中的對甲苯磺酸酯類遺傳雜質測定要求，可作為硫酸氫氯吡格雷遺傳毒性雜質的質量控制方法。