飼用枯草芽孢桿菌高產(chǎn)芽孢工藝優(yōu)化及菌劑制備

郭建軍， 熊大維， 曾 靜， 魏國汶， 杜建華， 袁 林

（1.江西省科學院微生物研究所，江西南昌330096；2.南昌工學院，江西南昌330108）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）屬于芽孢桿菌屬的一種，在自然界中廣泛存在，是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，對人畜無毒無害，可以分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性成分和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)， 具有廣譜抗菌活性 （Kimelman 等，2019）， 可在動物腸道內(nèi)產(chǎn)生生物奪氧作用，為乳酸菌生長提供厭氧環(huán)境，并對動物的營養(yǎng)物質(zhì)利用、生長、防病起到重要作用（Rhayat 等，2019）；該菌已被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入飼料添加劑目錄名單，重點應(yīng)用于微生態(tài)制劑方面，其因具有無毒無殘留和無污染等“綠色”飼料添加劑特點，而具有廣闊的發(fā)展前景（郝生宏等，2018）。

枯草芽孢桿菌生長快、營養(yǎng)需求簡單、易于存活、無致病性，且在生長發(fā)育后期形成含水率低的休眠體芽孢； 芽孢桿菌類微生態(tài)制劑因其獨特的芽孢存在形式， 有利于該菌在環(huán)境中生存繁殖和被生產(chǎn)加工與貯藏， 較其他種類微生態(tài)制劑具有更好的商品穩(wěn)定性， 故成為飼用微生態(tài)制劑近年的開發(fā)熱點。 不同學者采用單因素和正交試驗及響應(yīng)曲面法等對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化 （張紅艷等，2018）， 但多數(shù)培養(yǎng)基成分為牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等價格較昂貴的原料，不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。 而選用低成本培養(yǎng)基原料的研究中， 更多在于研究提高單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)量，對提高芽孢數(shù)量的研究較少。但從微生態(tài)制劑的角度考慮， 在工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)酵可達到的芽孢數(shù)直接影響微生物菌制劑的生產(chǎn)成本， 還決定著產(chǎn)品穩(wěn)定性及實際使用效果。 本試驗以前期從健康仔豬腸道中分離鑒定的枯草芽孢桿菌SR096 為出發(fā)菌株， 對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行PB 試驗、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化，以提高枯草芽孢桿菌的芽孢含量， 得到適用于工業(yè)化高產(chǎn)芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為枯草芽孢桿菌SR096 高產(chǎn)芽孢的工業(yè)化擴大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株：枯草芽孢桿菌SR096由本實驗室從健康仔豬腸道中分離篩選并保藏；種子培養(yǎng)基及計數(shù)培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：蛋白胨10 g/L，淀粉10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0；人工胃液：依次將稀鹽酸16.4 mL 和胃蛋白酶10 g 加入蒸餾水中混勻， 定容至1000 mL，pH 1.5，過濾除菌備用；人工腸液：取無水磷酸二氫鉀6.8 g 在800 mL 蒸餾水溶解，滴加氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 6.8， 再加入胰酶10 g 使其溶解，定容至1000 mL，微孔濾膜（0.22 μm）過濾除菌備用；0.3%膽鹽溶液：取3 g 牛膽鹽加入蒸餾水中使其溶解，定容至1000 mL，過濾除菌備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 菌株SR096 培養(yǎng)：將甘油保存的枯草芽孢桿菌SR096 在LB 平板上劃線， 并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，反復(fù)劃線兩次；再從劃線平板上挑取SR096 接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h 后作為種子液；按3%（V/V）將培養(yǎng)好的種子液接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中（每250 mL 三角瓶裝液量100 mL），37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

檢測方法：活菌計數(shù)采用平板菌落計數(shù)法；先將發(fā)酵液菌體失活（80 ℃水浴15 min），再平板菌落計數(shù)，即為發(fā)酵液芽孢含量，芽孢率為芽孢含量占活菌含量的百分比。

1.2.2 最適培養(yǎng)成分單因素試驗 選擇6 種碳源（葡萄糖、蔗糖、糖蜜、糊精、玉米粉、淀粉），7 種氮源（麥芽浸粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素、黃豆粉），7 種無機鹽（氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鉀、碳酸鈣、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鐵），在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上單因素改變碳源、氮源和無機鹽的種類，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基。 根據(jù)發(fā)酵液中活菌含量與芽孢含量，篩選出最適碳源、氮源和無機鹽。 在上述試驗基礎(chǔ)上，考察不同質(zhì)量濃度碳源（葡萄糖與玉米粉按質(zhì)量比為1:1 混合） （10、 15、20、25、30 g/L）、氮源 （酵母粉與黃豆粉按質(zhì)量比為1:1 混合）（15、20、25、30、35、40 g/L）、無機鹽（檸檬酸鈉、硫酸鎂、碳酸鈣） （0、1、2、3、4、5 g/L）對發(fā)酵培養(yǎng)后活菌含量與芽孢含量的影響， 得出各組分最佳濃度。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化試驗 PB 試驗：根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素的優(yōu)化結(jié)果， 采用PB 兩水平法，選用試驗次數(shù)N=16 試驗設(shè)計，對篩選出的葡萄糖、玉米粉、酵母粉、黃豆粉、檸檬酸鈉、硫酸鎂、 碳酸鈣7 種因素進行考察， 每個因素各取2個水平， 以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的芽孢含量為響應(yīng)值，篩選出對芽孢含量影響顯著的因素。

最陡爬坡試驗： 對PB 試驗設(shè)計篩選得到的顯著影響因素進行最陡爬坡試驗， 確定最陡爬坡試驗的方向和梯度，快速逼近最佳區(qū)域，確定試驗因素的中心點。

BBD 試驗： 由PB 試驗確定的3 個顯著因素為自變量和最陡爬坡試驗確定接近響應(yīng)面區(qū)域顯著因素的具體濃度，利用BBD 設(shè)計3 因素3 水平試驗，以芽孢含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法分析各顯著影響因子的最佳濃度。

搖瓶驗證：應(yīng)用Design-expert V8.06.軟件對上述試驗所獲得的試驗數(shù)據(jù)構(gòu)建響應(yīng)面模型，進行擬合分析確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成， 進行搖瓶模擬驗證。

1.2.4 枯草芽孢桿菌干菌粉制備及其穩(wěn)定性 將發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液離心去上清液收集菌泥，在沉淀中再加入玉米粉、沸石粉、無水葡萄糖等載體混勻，70 ℃烘干后，粉碎過篩制備干菌粉。

分別稱取沉淀直接烘干粉和載體混勻烘干的干菌粉樣品1 g，置于80、90、100、110 ℃和120 ℃條件下處理15 min，冷卻，測定芽孢桿菌活菌數(shù)（n=3），考察干菌粉耐熱性能；取1 g 制備的干菌粉菌劑分別接種于100 mL 溶液（人工胃液、人工腸液、0.3%膽鹽）中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)0.5、1.0、1.5、2.0 h 和3.0 h 取樣，測定活菌數(shù)（n=3），考察干菌粉在模擬胃腸道中的穩(wěn)定性； 稱取干菌粉1 g裝入鋁袋塑封后保存于37 ℃、RH 60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，于10、20、40、60 d 和90 d 取樣測定活菌數(shù)（n=3），考察干菌粉的長期穩(wěn)定性。

2 結(jié)果分析

2.1 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗 不同碳源對SR096 發(fā)酵液活菌含量和芽孢含量的影響見圖1， 利用速效碳源蔗糖或葡萄糖為碳源時，SR096發(fā)酵液的活菌含量較高， 但以緩效碳源淀粉或玉米粉為培養(yǎng)基碳源時，芽孢含量較高；當碳源（葡萄糖與玉米粉按質(zhì)量比為1:1 混合） 濃度為15 g/L時，芽孢含量與芽孢率均較高。

不同氮源對SR096 發(fā)酵液活菌含量和芽孢含量的影響見圖2，以酵母粉為氮源時SR096 發(fā)酵液的芽孢含量較高， 以黃豆粉為氮源的芽孢率較高；當?shù)?（酵母粉與黃豆粉按質(zhì)量比為1:1 混合）濃度為30 g/L 時，芽孢含量與芽孢率均較高。

不同無機鹽對SR096 發(fā)酵液活菌含量和芽孢含量的影響見圖3， 培養(yǎng)基中無機鹽對SR096生長影響較大，當添加硫酸鋅、氯化鈉或氯化鉀時SR096 的生長繁殖明顯受抑制，當添加檸檬酸鈉、碳酸鈣或硫酸鎂可顯著提高SR096 芽孢含量與芽孢率，檸檬酸鈉、硫酸鎂和碳酸鈣的最適添加濃度分別為3、1 g/L 和2 g/L。

2.2 PB 試驗設(shè)計結(jié)果分析 根據(jù)前期研究結(jié)果，確定以葡萄糖（A）與玉米粉（B）為碳源，以酵母粉（C）與黃豆粉（D）為氮源，以檸檬酸鈉（E）、碳酸鈣（F）和硫酸鎂（G）為無機鹽，共7 種因素一起進行PB 設(shè)計試驗， 設(shè)計方案和試驗結(jié)果見表1，試驗方差分析結(jié)果見表2。 該模型的決定系數(shù)R2為82.91%，其校正后的決定系數(shù)R2adj為90.89%，模型的P 值為0.0013＜0.01，說明該模型能較好地擬合數(shù)據(jù)。 依據(jù)表2 的P 值大小可以看出，對SR096 初始培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢量具有顯著影響的因子依次是玉米粉（B）＞檸檬酸鈉（E）＞酵母粉（C），確定這3 個因素為主要影響因素進行下一步最陡爬坡試驗。

表1 PB 試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 PB 試驗方差分析結(jié)果

2.3 最陡爬坡試驗 由表3 可知，SR096 芽孢含量最高的發(fā)酵條件介于試驗組3 與試驗組5 之間，故以試驗組4 設(shè)為BBD 試驗的中心點，即玉米粉12 g/L、酵母粉12.5 g/L、檸檬酸鈉4.5 g/L。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果與分析 BBD 試驗設(shè)計及結(jié)果見表4， 對表4 中的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合， 得到擬合回歸方程為：R=-131.255+4.239X1+0.656X2+49.143X3-0.016X1X2-0.136X1X3+0.079X2X3-0.136X12-0.038X22-5.406X32。

表4 BBD 試驗結(jié)果

對表4 的數(shù)據(jù)進行方差分析結(jié)果見表5，模型P＜0.0001，說明模型極顯著，試驗方法真實可靠；X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X22、X32的P 值均小于0.05，說明這些因素對模型影響顯著；失擬項P = 0.1881＞0.05，表明失擬項不顯著，由此說明模型擬合度較好，試驗誤差小，且回歸方程的決定系數(shù)R2為0.9983， 修正決定系數(shù)R2adj為0.9961，因此可用該方程進行結(jié)果預(yù)測。

表5 BBD 試驗方差分析結(jié)果

根據(jù)上述回歸方程及回歸模型方程分析表繪出響應(yīng)面曲面圖和相應(yīng)等高線圖見圖4， 玉米粉、酵母粉和檸檬酸鈉兩兩交互作用對芽孢含量的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系，說明各因素之間存在交互作用，只有在各因素濃度適宜的條件下，枯草芽孢含量才會達到最大值。通過回歸方程對各個因素求導(dǎo)得到的響應(yīng)面存在一個極大值R，即當玉米粉為12.69 g/L、酵母粉為10.66 g/L、檸檬酸鈉為4.46 g/L時芽孢數(shù)量達到最大值77.64×108cfu/mL。

為了進一步驗證模型的預(yù)測值， 根據(jù)預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過3 次驗證試驗，在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)48 h， 菌株SR096 的平均芽孢含量為76.36×108cfu/mL，實際值與預(yù)測值擬合度達98.35%， 說明擬合方程能夠準確預(yù)測真實情況。 優(yōu)化后活菌含量為7.978×109cfu/mL，芽孢含量為7.636×109cfu/mL，芽孢率為95.7%，芽孢量較優(yōu)化前提高了6.9 倍。

2.5 枯草芽孢桿菌益生菌劑在不良環(huán)境下耐受能力與長期穩(wěn)定性 試驗制備的枯草芽孢桿菌益生菌劑的活菌數(shù)高達2000 億cfu/g， 但益生菌制劑在儲存或進一步處理過程中會遇到一些極端環(huán)境。從表6 中高溫試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當菌種已定營養(yǎng)條件不變時枯草芽孢桿菌的存活率隨溫度的升高而緩慢降低， 說明經(jīng)芽孢化和包被處理后可以顯著提高枯草芽孢桿菌益生菌劑對高溫環(huán)境的抵御能力； 在80 ～110 ℃時的存活率高達90%以上，說明益生菌劑可抵御110 ℃高溫， 在飼料生產(chǎn)中高溫制粒會對菌劑的活性無明顯影響。

益生菌劑只有耐受胃酸（pH 1.0 ～2.0）環(huán)境才能抵達小腸從而起到改善腸道菌群的作用。 從表6 中發(fā)現(xiàn)菌劑在人工胃液pH 1.5 中活菌數(shù)從1.5 h 開始下降，3 h 時下降幅度較大，說明芽孢化可以明顯提高益生菌劑在胃液中的存活率； 菌劑在人工腸液中隨著處理時間的延長活菌數(shù)不但沒有降低，反而緩慢增加，說明在人工腸液里菌劑中的芽孢進行了萌發(fā)與生長， 表明該益生菌劑可耐受動物胃腸液，到達小腸后可定植于腸道黏膜；小腸液中膽汁的作用主要是由膽酸鹽來實現(xiàn)， 菌劑在含有0.3%膽酸鹽溶液中處理3 h， 活菌存活率仍高達75%以上，說明該益生菌劑對膽汁溶液的耐受性較好。

本試驗采用37 ℃加速試驗法測定菌劑的貯存穩(wěn)定性。 由表6 可知，在37 ℃、相對濕度60%條件下儲存3 個月，該菌劑活菌數(shù)基本沒有衰減，表明該益生菌劑可在室溫條件保存， 且穩(wěn)定性良好。 本試驗制備的枯草芽孢桿菌益生菌劑具有耐熱、耐酸、耐膽鹽并能長期保存等優(yōu)點。

3 討論

碳源、 氮源和金屬離子是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成部分， 也是微生物細胞和代謝產(chǎn)物的重要營養(yǎng)物質(zhì)，不同細菌對各種營養(yǎng)物質(zhì)的需求量不同，通過單因素和正交試驗及響應(yīng)曲面法對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化使發(fā)酵液中的活菌數(shù)與芽孢產(chǎn)量提高。 焉兆萍等（2019）通過正交試驗方法確定以玉米粉和豆粕為主要碳氮源發(fā)酵培養(yǎng)72 h 后細菌總數(shù)可達62 億cfu/mL； 鄭雙鳳等（2017）對枯草芽孢桿菌NTGB-178 高產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝優(yōu)化后發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量為6.16×109cfu/mL。本試驗通過碳源、 氮源、 無機鹽等單因素優(yōu)化試驗，確定以葡萄糖與玉米粉為碳源，以酵母粉與黃豆粉為氮源，以檸檬酸鈉、碳酸鈣和硫酸鎂為無機鹽的初優(yōu)培養(yǎng)基；然后采用PB 試驗與BBD 試驗相結(jié)合的方法， 并且利用Design Expert 8.0 軟件進行響應(yīng)面法分析，篩選出3 個主要影響因素（玉米粉、酵母粉、檸檬酸鈉），通過響應(yīng)面法優(yōu)化后得到發(fā)酵培養(yǎng)基組成為： 葡萄糖7.5 g/L、 玉米粉12.69 g/L、酵母粉10.66 g/L、黃豆粉20 g/L、檸檬酸鈉4.46 g/L、碳酸鈣1.5 g/L、硫酸鎂2 g/L。 優(yōu)化后工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)48 h， 枯草芽孢桿菌SR096 的活菌含量為7.978×109cfu/mL， 芽孢含量為7.636×109cfu/mL，芽孢率為95.7%，芽孢量較優(yōu)化前提高了6.9 倍，有效提高了生產(chǎn)效率和降低了生產(chǎn)成本。

胡瑞萍等（2018）通過搖瓶單因素試驗考察了碳源、氮源對生防菌株芽孢產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)長效碳源（淀粉）適于生長和芽孢的形成，速效碳源（如淀粉）不利于芽孢的形成。 本試驗結(jié)果表明，用玉米粉和豆粕部分代替葡萄糖與酵母粉進行芽孢桿菌發(fā)酵，其中，以葡萄糖7.5 g/L、玉米粉12.69 g/L、酵母粉10.66 g/L、黃豆粉20 g/L 組配的培養(yǎng)基效果最優(yōu)，相比于傳統(tǒng)微生物發(fā)酵常用的碳氮源，這些組分來源廣、廉價易得，有利于降低生產(chǎn)成本。在優(yōu)化無機鹽單因素試驗中發(fā)現(xiàn)，添加檸檬酸鈉、碳酸鈣、 硫酸鎂可顯著提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)與芽孢產(chǎn)量，與Posada-Uribe 等（2015）得出的結(jié)論相似。本試驗通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分，優(yōu)化后獲得的培養(yǎng)基成分簡單且價廉易得， 顯著提高了枯草芽孢桿菌SR096 發(fā)酵液的活菌含量與芽孢量，降低生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的要求。

微生態(tài)制劑面臨的主要問題是不能耐受制粒過程中的高溫高壓環(huán)境和動物的胃腸道溶液的低pH 及長距離運輸和長時間貯存。本試驗證實制備的枯草芽孢桿菌菌劑富含大量包被的芽孢， 能耐高溫和耐受動物胃腸道的胃液、腸液和膽汁，菌劑活菌數(shù)基本不下降，并且能在常溫下長期貯存。

表6 枯草芽孢桿菌益生菌劑的穩(wěn)定性

4 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗和響應(yīng)面法試驗優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖7.5 g/L、玉米粉12.69 g/L、酵母粉10.66 g/L、黃豆粉20 g/L、檸檬酸鈉4.46 g/L、碳酸鈣1.5 g/L、硫酸鎂2 g/L，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h，枯草芽孢桿菌SR096 菌株發(fā)酵液中芽孢含量可達7.978×109cfu/mL，制備的枯草芽孢桿菌菌劑富含大量包被的芽孢， 能耐高溫和耐受動物胃腸道的胃液、腸液和膽汁，菌劑活菌數(shù)基本不下降，并且能在常溫下長期貯存。