二維薄層色譜法在苦參生物堿成分分析中的應用*

張瀟晗，鄭秋涵，支雅靜，楊夢婷，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200；2 河北省中藥配方顆粒技術創新中心，

薄層色譜法由于設備和操作十分簡便，被廣泛用于中藥等復雜樣品的初步分離和定性分析中。通常樣品點在展開劑的作用下在平面固定相上沿著一個固定方向展開(即一維薄層)，在展開劑和固定相之間的分配作用等相互作用下，分離成幾個樣品點[1-3]。二維薄層色譜法是在傳統的一維薄層色譜法的基礎上，通過引入具有正交性的固定相或者展開劑，在一維分離方向的正交方向上進行第二次的展開(及二維展開)，可以彌補一維方向上分離不充分的缺點，同時提供一維和二維上的比移值(Rf)進行雙重定性。相比與在一維方向上進行二次展開，二維展開的展開劑體系的選取更加靈活多樣[4-5]。

苦參苦，寒。歸心、肝、胃、大腸、膀胱經，具有清熱燥濕，殺蟲，利尿等功效，苦參中含有多種化學成分，主要以生物堿(苦參堿及氧化苦參堿)為主，其次為黃酮[6-7]。本研究以苦參中的生物堿為分析對象，建立二維薄層色譜分析的方法，提供多維度的分離信息，并采用離線的液質聯用技術綜合評價二維薄層的定性分離能力。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

滴管、尺子、鉛筆、硅膠板切割刀、薄層色譜硅膠預制板(型號HSG，規格200×100，質量標準魯Q/YT257-58，涂層厚度0.01～0.05 mm，硅膠粉粒度HPTLC8±2 μm≥80%，TLC 10～40 μm，散射參數：SX=3)、TLC板式加熱器、展開缸、點樣管、噴瓶、微型離心儀、吹風機、家用微波爐、AB SCIEX液質聯用儀器。

苦參堿、氧化苦參堿、苦參對照藥材購置于中檢所，氯仿、甲醇、乙腈、純凈水、氨水、冰醋酸、碘化鉍鉀(分子式BiI3·4KI，分子量1253.70，含Bi量不少于16.0%，含碘量不少于69%)均為試劑純，顯色劑：碘化鉍鉀0.85 g+10 mL冰醋酸+40 mL水。

1.2 實驗方法

二維薄層色譜方法，包括切板、點樣、一維展開、二維展開和顯色，具體如下。

1.2.1 切 板

用硅膠板切割刀將薄層板切成長寬相近的矩形，劃線(如圖1所示，兩線交叉處為點樣處，標有1D的為一維展開方向，標有2D為二維展開方向，一維與二維的展開方向互相垂直)，待用。

圖1 二維薄層色譜板的劃線示意圖

1.2.2 點 樣

取用一根干凈的點樣管吸取待測樣品點約10 μL于二維薄層板的點樣處，控制點樣大小，每次點樣后用吹風機烘干，反復多次直至點完所吸樣品溶液。

1.2.3 一維展開

取用一個干凈干燥的展開缸，向展開缸內加入一維展開劑，蓋蓋，使其密閉達到飽和狀態，5 min后將點好樣的硅膠板放入其中按照一維展開方向展開，使硅膠板的底端劃線處浸入一維展開劑中，蓋蓋，待硅膠板上的液體上升至距硅膠板頂端1 cm左右的位置，將其取出，置于TCL板式加熱器烘干。

1.2.4 二維展開

取用一個干凈干燥的展開缸，向展開缸內加入二維展開劑，蓋蓋，使其密閉達到飽和狀態，5 min后將硅膠板放入其中按照二維展開方向展開，使硅膠板的底端劃線處浸入二維展開劑中，蓋蓋，待硅膠板上的液體上升至距硅膠板頂端1 cm左右的位置，將其取出，置于TCL板式加熱器烘干。

1.2.5 顯 色

均勻噴灑顯色劑于硅膠板上，觀察實驗現象。

1.2.6 液質聯用測試條件

液相條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；以乙腈-0.1%乙酸(3:97)為流動相，流速：0.3 mL/min，進樣量：1 μL。

質譜條件：氣簾氣：35 psi；噴霧電壓：5500 V；溫度：550 ℃；氣路1:40 psi；氣路2:40 psi。采用MRM進行測試，苦參堿離子對：249.2/148.0，氧化苦參堿離子對：265.1/148.0。

1.2.7 液質分析樣品制備

將苦參提取液的二維展開板(未顯色)的目標區刮下，加入2 mL的90%乙醇溶液，再加入5 μL的冰醋酸，超聲2 min，離心，取上層清液，用0.22 μm濾膜過濾后，進行液質分析。將苦參提取液用0.22 μm濾膜過濾后，進行液質分析。

2 結果與討論

2.1 二維展開劑系統的篩選

選取不同的展開劑組合成二維展開體系進行實驗(所選展開劑見表1)，考察一維和二維展開情況，當一維展開劑使用氯仿:甲醇= 4:1，二維展開劑使用乙腈:水=9:1(氨水飽和)時，苦參提取液在一維和二維均能夠展開。采用篩選出來的二維展開體系，測試苦參提取物、苦參堿和氧化苦參堿的標準品供試液，對比二維展開結果。

實驗所用薄層色譜板的材料為硅膠，表面具有硅羥基，是極性較強的分離介質，通常可以用于正相色譜分析，也可以用作親水相互作用色譜分析。因此一維展開采用分析生物堿的常用展開劑可以分離出生物堿，而二維展開劑采用高比例的乙腈，在親水相互作用模式下可以對一維粗分離得到的斑點進行進一步分離。

2.2 二維薄層色譜分析結果

采用篩選出來的二維展開劑體系，測定苦參提取液、苦參堿和氧化苦參堿標準品。見圖2～圖4。各二維薄層的比移值見表2。經過Rf值的初步對比分析，苦參提取液在二維展開后得到的斑點1為氧化苦參堿，斑點2未知，未見苦參堿的斑點。

圖2 苦參提取物的二維薄層色譜圖

二維薄層色譜可以在第二維對第一維無法分離的斑點提供進一步分離，相比二次展開，展開劑選擇更為廣泛，不必考慮對其他斑點的影響。此外，二維薄層色譜為每一個斑點提供2個Rf值作為定性比對的基礎，采用雙Rf值對比，可以提供更準確的定性分析結果。

圖3 苦參堿標準品的二維薄層色譜圖

圖4 氧化苦參堿標準品的二維薄層色譜圖

表2 二維薄層色譜的Rf值

2.3 液質聯用分析

將苦參提取液的二維展開板(未顯色)的斑點1和斑點2的區域(以下稱氧化苦參堿區)，以及苦參堿標準品的對應區域(以下稱苦參堿區)刮下(刮板情況見圖5)，按照2.4.2項下方法進行提取處理，然后進行液質分析。

圖5 苦參提取液的二維薄層刮板情況

苦參提取液、二維展開后的苦參堿區、氧化苦參堿區的液質分析結果見圖6～圖7。苦參提取液中含有苦參堿和氧化苦參堿。苦參堿區雖然沒有觀察到生物堿的顯色斑點，但仍有苦參堿的離子對信號。氧化苦參堿區除了氧化苦參堿的離子對之外，還存在苦參堿的離子對信號，由于該區域并不是苦參堿的二維展開區，因此該信號(即斑點2)可能為苦參堿的同分異構體，可能為槐定堿。

圖7 苦參堿的液質圖

圖6 苦參提取液的液質圖

由于液質聯用的檢測限遠遠高于薄層顯色，因此二維薄層的不同區在液質聯用中的純度并不高，主要原因是薄層顯色僅為濃度高的區域，而硅膠底部的低濃度區無法顯色，但仍然能夠被質譜檢測到，其他原因還可能是苦參提取液的濃度不夠高、斑點2為苦參堿的同分異構體。

圖8 氧化苦參堿的液質圖

3 結 論

本研究充分利用薄層色譜硅膠板的性質，建立的二維薄層色譜分析方法，并用于苦參提取物的分析，二維薄層色譜可以在第二維對第一維無法分離的斑點提供進一步分離，并且能夠每一個斑點提供2個Rf值作為定性比對的基礎。采用液質聯用技術對薄層展開斑點區進行進一步驗證，對二維薄層色譜方法的優缺點的客觀評價提供了強有力的證據。