草甘膦農藥對斑馬魚的急性毒性和慢性毒性研究*

廖藝鈺，惠呂佳，嚴吉祥，計偉佳，陳夏偉，楊華云

(杭州師范大學錢江學院，浙江 杭州 310018)

隨著社會現代化的不斷發展，各種污染物大量地進入水體環境，農藥作為一種十分常見的污染物，是水域安全評價的重要指標。作為有機氯農藥的替代品，有機磷農藥在我國使用量非常大。該類農藥是一類高效經濟的常用殺蟲殺螨劑，但其利用率非常低，約在20%左右，剩下的80%則全部進入環境中。經過生物富集與食物鏈的傳遞和逐級濃縮、放大等作用，有機磷農藥對生物和人類的健康以及環境造成很大的危害。通過河流、大氣工業排放等方式，有機磷農藥一般最終將匯入海洋，因此海洋成為了有機磷的最終歸宿。然而，大多數海洋生物對有機磷農藥十分敏感，因此引發大量的魚、蝦、貝等的大量死亡，危及了非靶生物的生存，導致海洋動物數量劇減，甚至滅絕，威脅到海水養殖業的可持續發展[1]。草甘膦對人和土壤生物等均有不同程度的毒性，但目前關于這種除草劑對水生態危害的報道較少，研究斑馬魚對這種除草劑的響應，旨在引起人們關注水生態中除草劑的安全問題，并為其合理施用提供科學依據。本文以斑馬魚作為模式生物，研究有機磷農藥對斑馬魚的急性毒性以及慢性毒性的影響，以期得到有機磷農藥對斑馬魚的毒性效應，為保障居民身體健康以及環境保護提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材 料

作為國際標準化組織推薦的實驗魚種，斑馬魚購于杭州某花鳥市場，平均體長1～2.5 cm，體重100～400 mg。草甘膦農藥標準品購于國家標準物質中心，實驗時需要現配現用。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性實驗

(1)斑馬魚預先購買放置在實驗室內馴養7 d，每24 h喂食一次，實驗用水為實驗室蒸餾水，目的是排除氯離子的干擾，并同時使用增氧泵，保證溶解氧≥5.0 mg/L，試驗用水溫度控制在(25±1)℃，試驗前兩天停止喂食。

(2)經過預實驗，確定各實驗藥物的質量濃度范圍(96 h全活質量濃度上限和96 h全致死質量濃度下限)后，在室溫條件下，在長寬高為20×17×15(cm)的魚缸中，按一定的間距設置不同的濃度梯度組，試驗共五組，一組空白對照組，采用靜態實驗法，開展單一有機磷農藥對斑馬魚的急性毒性實驗。每個濃度梯度放置10尾實驗動物，各魚缸中溶液的體積均為2 L，連續觀察受試對象的活動狀態，以用鑷子觸碰魚頭部5 s以上完全無反應作為死亡判斷標準，及時取出死亡個體，分別記錄24 h，48 h，72 h，96 h的死亡數量，計算一次的總體平均死亡率。

(3)數據處理

采用寇氏法[2]計算斑馬魚的半致死濃度LC50：

LogLC50=Xm-d(∑P-0.5)

安全質量濃度SC按以下公式計算：

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.2.2 慢性毒性實驗

(1)斑馬魚的馴養過程和急性毒性實驗的馴養過程相同，試驗前兩天停止喂食，根據急性毒性實驗的結果，設置5個不同濃度梯度的實驗組，一個空白對照組，每個濃度梯度放置10尾魚。采用靜態實驗法，分別于1 d，7 d，14 d后采集樣本。

(2)酶的測定

分別在7 d、14 d時，在每缸中取5尾實驗動物，在冰塊上冰麻后稱量其體重，放入勻漿管中，再按照體重49倍加入生理鹽水進行勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。將配制好的勻漿用離心機1500 r/min進行離心10 min，離心后取上清液放入1 cm光徑比色皿，于412 nm處使用分光光度計測量其吸光度，空白管用來調零，測各管的吸光度。同標準乙酰膽堿酯酶溶液對比后并計算酶活。

(3)標準曲線配制

精確量取乙酰膽堿酯酶的標準液，分別制得0、0.2、0.4、0.6、1 ppm的酶溶液，以酶濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。得到標準曲線為Y = 0.3599x-0.0046，相關系數R2=0.9967。實驗以此標準曲線為準。

圖1 乙酰膽堿酯酶標準曲線

(4)數據處理

酶活計算公式：

式中：ΔA412為反應前后吸光度的差值；V為反應體系總體積；ε為產物的摩爾吸光系數；T為反應時間；d為比色皿寬。

2 結果與討論

2.1 斑馬魚急性毒性實驗試驗結果

草甘膦對斑馬魚的急性毒性實驗結果表明：草甘膦濃度達到2.0 mg/gL以上時，24 h內試驗魚全部死亡；草甘膦的濃度達到3.0 mg/gL時，2 h內個別魚開始出現側翻，身體不平衡的現象，8 h后在底部掙扎，嚴重失衡，12 h內全部死亡。隨著時間的推移，各個濃度的魚都有出現個別死亡。草甘膦對斑馬魚的毒性比較強，斑馬魚剛開始出現急躥現象，而且伴有集群現象，但很快就消失，稍后魚群都聚集在水底。隨著中毒程度的加深，魚出現了身體不平衡、顫抖或者游動緩慢，身體開始立于水中，出現了反應遲鈍，張口喘氣等中毒現象，最后鰓部充血死亡，腹部朝上浮在水面上，或者以側躺的姿勢沉在水底。濃度高的組別從開始試驗、中毒到死亡時間更短，中毒效果也更加明顯。

2.2 斑馬魚對草甘膦急性毒性的LD50和安全濃度的評價

斑馬魚對草甘膦急性毒性的半致死濃度和安全濃度如表1所示。根據國家環保局發布的毒性分類標準[3]，急性毒性96h LC50<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。本實驗結果表明，草甘膦的96h LC50為0.879 ppm，屬于高毒農藥。草甘膦是目前使用最廣泛、用量最大的除草劑種類之一，如此高毒性農藥的大量使用并在環境中大量殘留會給環境帶來了巨大的潛在風險。有研究表明近年其主要用于治理河塘、湖泊中的水生雜草，在水中的殘留會對魚類的生存產生較大的危害[4]。

表1 草甘膦對斑馬魚的LD50和SC

2.3 斑馬魚對草甘膦慢性毒性試驗的結果

有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶酶活性的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著時間的推遲，乙酰膽堿酯酶的酶活會持續降低且濃度越高，乙酰膽堿酯酶的酶活越低。但隨著時間的無限延長，乙酰膽堿酯酶的酶活下降幅度會逐漸減少，并穩定在一個確定值范圍內，直至生物體死亡。高濃度有機磷農藥的使用將使得水生生物出現大批量的死亡現象，即使濃度較低，毒素也會在生物體內滯留，并影響其正常新陳代謝，經過生物放大作用，甚至影響人類健康，但同時經過實驗研究以及對文獻的分析，發現如今水生生物已經對有機磷農藥出現了抗性，且不同水域的抗性不盡相同[5-6]。Modesto等[7]研究發現，草甘膦制農藥能對魚類產生毒害作用，具體表現為：血液中的血球容積增大，體內的抗氧化酶活性改變，紅細胞和白細胞數量增加。Lajmanovich等[8]報道，草甘膦對水生動物魚、蝦、青蛙、蝌蚪等產生毒害，草甘膦農藥在施藥48 h后降低青蛙體內乙酰膽堿脂酶和谷胱甘肽酶活性，且3.80 mg/L草甘膦可使蝌蚪大量死亡。劉曉偉等[9]也研究表明，低濃度的草甘膦對多刺裸腹溞具有毒性，LC50(48 h)=26.29 mg/L。

圖2 有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶酶活性的影響

3 結 論

我國是產糧、用糧大國，農藥的使用問題一直以來都是國民關心的重要問題。而農藥本身的安全性與使用上的科學性的提升是對我國現階段的發展來說至關重要的因素。本實驗以斑馬魚為模式生物，嘗試性地探究有機磷類農藥草甘膦在斑馬魚身上的急性與慢性毒性效應。急性毒性結果表明，草甘膦屬于高毒農藥，其96 h LC50為0.879 mg/L；慢性毒性表明，草甘膦農藥會顯著得抑制乙酰膽堿酯酶的活性。那么對于草甘膦農藥的使用，給出以下建議：在進行農藥施藥時，不要逆風和在大風天以及高溫時段噴藥，在保證農藥適用范圍之外，減少農藥的污染面積，以及高溫揮發對空氣的污染，特別是環湖邊的農田尤其不要再大風時候施藥。同時應該嚴格控制農田中高農藥的使用情況以及在使用過程中時刻觀察附近生物的活動情況。