響應面法優化半夏總黃酮的提取工藝*

陳 亮，孫德妹 ，丁 嵐,2，劉 映,2

(1 南華大學藥學院藥學系，湖南 衡陽 421001；2 湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心，湖南 衡陽 421001)

半夏，天南星科植物，其拉丁名為 Pinellia ternate (Thumb.) Breit.。半夏是我國用藥歷史超千年的傳統中藥，其干燥塊莖經炮制后具有散瘀止痛、解毒消腫、治療跌打勞傷等功效[1-4]，經現代藥理研究發現，其還具有抗心律失常、催吐、抗腫瘤、抗潰瘍、治療冠心病、祛痰、止咳、抗血凝等藥理作用[5-8]。半夏的藥理活性廣泛，成分復雜，研究表明其含有大量的多糖、淀粉、β-谷甾醇、生物堿、植物凝集素、葡萄糖苷等。近年來，分離與檢測技術的不斷發展，研究者從半夏中又分離得到多種成分，如大黃酚、5-羥甲基糠醛、豆甾-5-烯、甘油酯等[9-10]，但是對于半夏中黃酮的含量及提取方法還鮮有研究。研究者使用薄層板對清半夏的醇提液進行點樣跑板分析，發現其含有總黃酮類化合物，在上述基礎之上，本文利用清半夏作為原料，使用響應面法考察了乙醇浸提法提取半夏中總黃酮時不同因素對于提取率的影響，優化了半夏中總黃酮類物質的乙醇浸提工藝，旨在為半夏的資源開發及利用提供理論指導。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

清半夏，購自張仲景大藥房；蘆丁(標準品，100080-200707)，中國藥品生物制品檢定所；乙醇(AR)、亞硝酸鈉(AR)、氫氧化鈉(AR)、硝酸鋁(AR)，天津市大茂化學試劑廠。

UV-1750紫外可見分光光度計，日本島津；SY-1220恒溫水浴槽，上海珂淮儀器有限公司；MS105DU電子天平，梅特勒。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制定

精密稱取蘆丁標準品，用30%的乙醇溶液將其溶解定容至0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL，加入5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；之后加入10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；隨后加入4%的氫氧化鈉并用30%的乙醇定容，靜置后在510 nm處測吸光度[11-13]。根據數據繪制標準曲線并得出線性回歸方程為y=10.386x+0.012，R2=0.9994。

1.2.2 總黃酮提取工藝及含量測定

將半夏洗凈，烘干至恒重，粉碎后過100目篩，干燥備用。稱取1 g處理后的半夏，選取不同的乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度進行提取，過濾后將濾液旋干至固體，隨后用30%的乙醇溶解定容，按照1.2.1的方法測定溶液吸光度值，根據蘆丁標準曲線計算粗提物中總黃酮含量，并按下面的公式計算總黃酮的提取率[14-17]。

提取率Y=[(C×V×D/W)1000]×100%

式中，C為提取液中蘆丁的濃度，g/mL；V為抽濾后獲得的各浸提樣本的總體積mL；D為稀釋倍數；W為稱取的半夏粉末質量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對半夏總黃酮提取率的影響

將提取溫度和提取時間分別設定為60 ℃及2 h，料液比設定為1:30(g/mL)，采用乙醇浸提法來考察不同的乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對提取率的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對半夏總黃酮提取率的影響

由圖1可知，當乙醇濃度為40%～60%時，總黃酮提取率會隨著乙醇濃度的增大而增加；當乙醇濃度大于60%時，總黃酮提取率達到了最大值，隨后，隨著乙醇濃度的增加，提取率趨于平緩甚至有所下降。可能是60%乙醇濃度下半夏中總黃酮的溶解度更好，考慮到提取工藝中黃酮提取率及提取成本等綜合因素，最終選擇乙醇濃度為60%。

2.1.2 料液比對半夏總黃酮提取率的影響

結合前面的結果，將乙醇濃度設定為60%，提取時間和提取溫度分別設定為60 ℃及2 h，在此條件下考察不同的料液比1:10、1 :20、1 :30、1 :40、1:50(g/m L)對半夏中總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對半夏總黃酮提取率的影響

由圖2可知，提取率會先隨著料液比的增加而提高，然后提取率達到峰值，之后提取率會隨著料液比的繼續增加而降低。料液比為1:40時黃酮的提取率最大。

2.1.3 半夏黃酮類化合物提取率受提取溫度的影響

基于前期的實驗結果，將乙醇濃度設定為60%，料液比設為1:40 (g/mL)，提取時間為2 h，考察不同的提取溫度40、50、60、70、80 ℃對半夏中總黃酮提取率的影響。結果如圖3所示，提取率會先隨著溫度的增長而提高，60 ℃時黃酮的提取率達到峰值，隨后，隨著溫度的增加，提取率的增加不明顯。分析可能是溫度的升高有利于半夏中總黃酮物質的溶出，在短時間內可以達到固態平衡，從而提高其提取率；而另一方面，溫度的升高也會加速總黃酮物質的氧化、縮合、降解等反應，從而降低其提取率。考慮到提取率及提取時的經濟性及安全性，選擇溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對半夏總黃酮提取率的影響

2.1.4 半夏總黃酮提取率受時間的影響

基于前面的實驗結果，將乙醇濃度設定為60%，料液比設為1:40 (g/mL)，提取溫度設定為60 ℃，考察不同的提取時間1、2、3、4、5 h對半夏中總黃酮提取率的影響，結果見圖4。

由圖4可知，提取率會先隨著時間的增加而增加，然后提取率達到峰值，之后提取率會隨著時間的繼續增加而降低。3 h時其提取率最大，有可能是隨著時間的增加，部分黃酮類物質發生降解，致使提取率降低。

圖4 提取時間對半夏總黃酮提取率的影響

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面優化實驗設計

按照以下的因素水平表(表1)，通過Design-Expert 8.0軟件對本次實驗進行設計與結果的統計，見表2，并分析數據結果[18-19]。

表1 因素水平表

2.2.2 響應面優化實驗結果

基于前面的單因素實驗結果，根據Box-Behnken中心組合原理，以半夏中總黃酮的提取率為響應值進行分析，結果如表2所示。

表2 響應面設計實驗結果

續表2

2.2.3 模型方程的建立與顯著性檢查

通過Design-Expert 8.0軟件對以上的四個因素數據進行多元回歸擬合，根據實驗結果回歸模型方程擬合后所得的響應曲面二次多元回歸模型方程為：

Y=7.78+0.99*A+0.010*B-0.20*C+0.64*D+0.25*A*B-0.63*A*C+0.30*A*D-0.38*B*C+1.13*B*D-0.35*C*D-2.12*A2-1.47*B2-0.77*C2-0.75*D2-0.69*A2*B-0.74*A2*C-0.94*A2*D-0.48* A*B2-0.82*A*C2-0.29*B2*C-0.41*B2*D-0.15*B*C2

R2=0.9889

式中，Y為總黃酮提取率，%；A為乙醇濃度；B為提取溫度；C為提取時間；D為料液比。分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

續表3

該模型的相關系數為0.9889，說明該模型與實際實驗的誤差小，模型的擬合度較好，采用改模型進行半夏中總黃酮的提取工藝優化是可行的。從一次項系數分析得出，各個因素對半夏中總黃酮的提取率的相對影響大小為：乙醇濃度>料液比>提取時間>提取溫度。由表3回歸模型方差分析可得：乙醇濃度與料液比(P<0.01)對半夏總黃酮的提取有極顯著的影響；提取溫度及提取時間(P>0.05)對提取率無顯著影響。信噪比Adeq Precision為16.924>4，說明該模型可用于預測；失擬項(P>0.05)不顯著，說明方程的擬合效果較好。

2.2.4 響應曲面分析

實驗各因素間交互作用如圖5～圖10所示。響應面坡度平緩表明因素對總黃酮提取率影響較小，橢圓曲線排列密集說明該因素對總黃酮提取率影響大，等高線越接近橢圓形，表明兩因素交互作用越明顯[20]。綜合分析圖5～圖10可直觀地看出，乙醇濃度和料液比對總黃酮的提取率影響最明顯(圖7)，提取時間和乙醇濃度、料液比之間對總黃酮提取率的交互作用明顯(圖6、圖10)。

圖5 乙醇濃度與提取溫度對總黃酮提取率的交互作用

圖6 乙醇濃度與提取時間對總黃酮提取率的交互作用

圖7 乙醇濃度與料液比對總黃酮提取率的交互作用

圖8 提取溫度與提取時間對總黃酮提取率的交互作用

圖9 提取溫度與料液比對總黃酮提取率的交互作用

圖10 提取時間與料液比對總黃酮提取率的交互作用

2.2.5 半夏總黃酮最佳提取條件驗證實驗

由優化后的模型可知，最佳提取工藝為：提取時間2.61 h、提取溫度62.7 ℃、料液比1:47 (g/mL)、乙醇濃度62.5%。在此條件下測得的實際總黃酮提取率為8.19%，與預測值8.22%基本吻合，說明回歸模型與實際提取情況擬合較好。

3 結 論

本次實驗首先從乙醇提取濃度、提取的時間、提取的溫度和料液比等四個方面對半夏中總黃酮提取率的影響進行了單因素實驗測定，在此基礎上，使用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計響應曲面的實驗，得到了較好的提取工藝條件，并對此進行了驗證實驗。得到的最佳提取工藝條件為：提取時間2.61 h、提取溫度62.72 ℃、料液比1:47.10 (g/mL)、乙醇濃度62.54%，總黃酮的提取率達到了8.19%。利用乙醇浸提法對半夏中總黃酮進行提取，提取方法簡單，不需使用復雜的儀器，優化后的工藝條件溫和，提取率較高，對半夏的綜合開發與藥效成分利用提出了新的理論基礎與方向。