尾礦藻表面磷調控及其強化固定重金屬研究

夏 令 王芷芯 黃 容 王 朕1

（1.礦物資源加工與環境湖北省重點實驗室，湖北武漢430070；2.國土資源部稀土稀有稀散礦產重點實驗室，湖北武漢430070；3.武漢理工大學資源與環境工程學院，湖北武漢430070）

鉛（Pb2+）等重金屬離子由于其毒性和難降解性對人體健康和生態環境具有巨大危害［1-2］。其主要來源于采礦、電池、染料、制造、充電等工業的生產制造，低濃度的鉛可導致許多嚴重的疾病，如貧血、高血壓、腎病綜合征和肝炎等［3-4］。吸附是去除重金屬的一個非常好的方法，其中生物吸附因其價廉易得，無二次污染等優勢獲得越來越多的重視。

生物吸附劑中，微藻細胞壁上含有豐富的官能團，主要包括羥基、羧基和氨基等，具有很高的富集重金屬的能力［5］，微藻具有繁殖快、易培養、可選擇種類多等特點，具有廣闊的應用前景。目前應用的微藻吸附劑多是干燥或預處理的藻類生物質干物質［6-7］。相比之下，活藻吸附更具有優勢，首先，活藻在生長過程中，可以同時去除重金屬和過剩營養物（硝酸鹽和磷酸鹽）［8-9］；此外，活藻的胞內吸收和累積作用，可降低部分污染物如磷元素的殘留［10］；更重要的是活藻吸附相較于死藻等生物吸附質，省略了干燥、活化等加工步驟，可以更好地應用于實際工程中［11］。

活藻本身對重金屬的吸附能力弱，磷調控可以增加微藻的耐受性，強化重金屬的固定能力，因此本實驗通過改變培養基中的磷濃度對微藻進行改性［12］。實驗利用Zeta電位儀測定藻表面的負電性，探究pH對藻類吸附重金屬的影響［13］，利用傅里葉紅外光譜法（FT-IR）對吸附前后的微藻進行表征，判斷微藻表面官能團種類，另外通過自動電位滴定儀測定的數據，模擬出微藻表面官能團的濃度，以期獲得對吸附機理的深刻認知。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的微藻Didymogenes palatinaXR，分離自廣東省韶關市凡口尾礦廢棄地。經土壤分離純化后的藻種培養在BG-11培養基中。1 L的BG-11培養基中含有300 mg NaNO3，36 mg CaCl2·2H2O，6 mg檸檬酸銨，6 mg檸檬酸鐵銨，1 mg EDTA，2.86 mg H3BO3，1.81 mg MnCl2·4H2O，0.222 mg ZnSO4·7H2O，0.39 mg NaMoO4·5H2O，0.079 mg CuSO4·5H2O，0.050 mg CoCl2·6H2O，40 mg K2HPO4。

分離純化出來的藻種在上述BG-11培養基中活化3 d后接種到不同濃度磷培養基種。BG-11培養基中磷濃度分別為40 mg/L，80 mg/L，160 mg/L，200 mg/L。每種磷濃度下的藻培養3組平行樣。所有的藻樣置于恒溫恒濕箱中進行培養，以光照14 h、黑暗10 h周期晝夜循環，溫度設置為25℃。培養在40 mg/L，80 mg/L，160 mg/L，200 mg/L的活體微藻分別被命名為B-40，B-80，B-160，B-200。

1.2 試驗方法

吸附試驗所用到的Pb2+溶液是通過稀釋1 000 mg/L的Pb（NO3）2溶液得到的。將藻樣置于有2 mL Pb2+溶液的帶蓋離心管中，混勻后置于恒溫搖床上振蕩，溫度設置在25℃，轉速為150 r/m。通過調節Pb2+溶液的初始pH為3、4、5、6來探究pH對藻類吸附重金屬的影響。吸附等溫線在Pb2+初始濃度為2～20 mg/L下進行。

1.3 分析方法

1.3.1 微藻生物量及磷濃度的測試

微藻的生物量濃度（BC，g/L）在波長范圍450～680 nm內與光密度呈線性關系。實驗選擇680 nm的光密度（OD680）來測量Didymogenes palatinaXR的生物量濃度，OD680與Didymogenes palatinaXR在紫外分光光度計下的生物量濃度的線性關系式［14］如下：

實驗采用鉬銻比色法測定了培養基中的總磷，紫外分光光度計波長設置為700 nm。

1.3.2 Pb2+生物吸附量的計算

用原子吸收光譜法（ZEEnit700，Analyjena，Germany）測定初始Pb2+濃度及實驗后上清液中的Pb2+濃度，通過式（2）計算活藻對重金屬離子的吸附量。

式中，Qe為活藻對重金屬離子的吸附量，mg/g；C0為重金屬溶液的初始濃度，mg/L；Ce為吸附完成后離心得到的上清液中的重金屬離子濃度，mg/L；M為用于吸附的活藻質量，g；V為重金屬溶液的體積，L。

1.3.3 吸附等溫線模型

實驗使用Langmuir模型（式（3））、Freundlich模型（式（4））和Temkin模型（式（5））對測得的活藻吸附量數據進行了模擬，計算式如下：

式中，Qm為活藻吸附重金屬離子的最大吸附量，mg/g；KL、Kf、A、B分別為Langmuir、Freundlich和Temkin常數；n是吸附強度的平衡常數。

1.3.4 pH對微藻吸附實驗的影響

通過Zeta電位儀（Malvern Zetasizer Nano ZS90）測定在pH變化的條件下微藻細胞表面的負電性。利用Medusa軟件模擬出不同pH條件下金屬Pb2+在環境中的存在形式。

1.3.5 藻表面特性的表征

利用傅里葉紅外光譜法（FT-IR）在波長為400～4 000 cm-1的條件下測定出微藻表面官能團的特征峰，并通過光譜分析探究微藻表面結合金屬離子的特異性官能團種類。使用自動電位滴定儀測定微藻細胞表面的結合位點，并利用ProtoFit軟件計算表面官能團濃度。

2 試驗結果與討論

2.1 藻細胞載磷改性

微藻Didymogenes palatinaXR在不同磷濃度下培養的生長曲線如圖1所示。藻類生長的4個時期包括延滯期、對數增長期、穩定期及衰亡期［15］。由圖1可知，0～2 d時該藻生長緩慢；在第2 d后藻類生物量迅速增加，說明細胞進入對數增長期；至第6 d時藻類生物量增長趨緩，生長進入穩定期；在第8 d達到最大生物量后進入衰亡期。微藻在第8 d的平均生物量最大，故采用第8 d的微藻細胞進行吸附實驗。

微藻在不同磷濃度培養條件下生長至第8 d時的生物量及其對培養液中磷的去除率如表1所示。隨著培養基磷濃度的增加，微藻生物量有所提高，而B-200的生物量明顯低于其他條件下生長的微藻，說明過高磷濃度會抑制微藻生長。本實驗中最適宜微藻生長的磷濃度為160 mg/L。此外，研究分析了藻細胞對培養基中磷元素的去除率，去除率超過90%，說明活藻細胞可以應用于治理環境磷污染。

2.2 不同表面載磷微藻對Pb2+的吸附

2.2.1 pH影響

圖2（a）為不同pH下微藻對Pb2+的去除率。由圖2（a）可以得知，隨著pH的增大，各種改性藻體對金屬離子的去除率均有提高，特別是在pH由3上升至4時，去除率有顯著提升，而在不同pH下，B-160的去除效果始終最為優異。

圖2（b）顯示不同載磷微藻的Zeta電位。不難發現，在pH為2～10的范圍內，細胞表面負電性隨pH的升高而增強。Pb2+在測試范圍內始終以二價陽離子形式存在，藻細胞表面負電性越大，對金屬離子的靜電吸引力也越大，因此隨pH的增大，細胞的吸附能力也會增強。圖中細胞表面的負電荷數在pH=4時有一個明顯的拐點，在這之后細胞表面的負電性變化趨緩，這解釋了活藻細胞在pH＞4后吸附量增加緩慢的原因。此外，在較低pH的情況下，細胞壁表面的官能團容易質子化，造成金屬陽離子與氫離子（H+）的競爭吸附，導致細胞表面可供金屬離子吸附的結合位點減少，從而降低了微藻細胞的吸附能力［16］。不同pH下Pb2+在環境中的分布情況如圖3所示，在pH＞6時會形成Pb（OH）2沉淀。由于金屬鹽的沉淀形式難以被活藻細胞吸附［17］，并且在pH＞6后，藻細胞表面的負電性幾乎不變。故本實驗通過研究pH對微藻吸附Pb2+的影響，藻體吸附Pb2+的最適宜pH為6。

2.2.2 吸附等溫線

目前常見的吸附等溫線主要包括Langmuir、Freundlich和Temkin模型［18］。實驗研究了在初始Pb2+濃度不同的條件下微藻的吸附能力，其關系如圖4（a）所示。本實驗將所得數據使用Langmuir、Freundlich和Temkin模型進行擬合，其中Fitted Langmuir是將非線性形式的Langmuir吸附等溫線轉化為線性形式，目的是為了更好地估算參數。擬合后的Pb2+吸附等溫線分別如圖4（b）～（d）所示。

藻吸附Pb2+的等溫線擬合參數總結于表2之中。通過表2可以看出，Langmuir的參數R2較Freundlich、Temkin的總體要更高一些，說明重金屬離子鉛在細胞表面的吸附主要為單層吸附。同時，通過Freundlich模擬參數中的n＞1可以看出，藻與Pb2+的結合效果良好。并且，Temkin模型中的參數B＜8說明在吸附過程中存在著重金屬離子通過微弱的范德華力相互作用于微藻上［18-19］。

Langmuir模擬顯示，B-160對Pb2+的飽和吸附量最大，為7.93 mg/g。不同磷濃度下培養的藻對Pb2+的吸附能力為B-160＞B-200＞B-80＞B-40，顯然，通過磷改性后的藻細胞其吸附能力明顯高于正常磷濃度下生長的B-40，研究表明磷基基團與重金屬離子有著較強的結合能力，而磷改性后微藻表面的磷基官能團增加。

2.3 吸附機理

2.3.1 FT-IR

為了研究微藻表面所含有的官能團種類及其行為變化［20］，本實驗利用紅外光譜法對吸附Pb2+前后的B-160進行表征。B-160吸附Pb2+前后的FT-IR譜圖如圖5（a）所示，圖5（b）為局部區域的放大圖。吸附前后振動峰的變化被列于表3之中。

峰值為 3 300.87 cm-1代表的是羥基［21］。2 800～3 000 cm-1波段的峰值是脂肪族官能團 CH 和 CH2［22］，峰值為1 659.34 cm-1的官能團與共軛醛/酰胺彎曲蛋白中的＞C=O有關，出現在1 547.16 cm-1處的峰值為縮氨酸基團CN。吸附前后峰值在1 456.52 cm-1處的波動是由于羧酸類的C=O在參與吸附反應時發生共軛效應所導致的，在3 300.87 cm-1處的波動說明羥基參與了吸附過程［23］。此外，峰值為1 253.12 cm-1所表征的P=O基團只有在含磷培養基中生長的微生物細胞壁上出現，吸附前后峰值的變化說明P=O基團在吸附過程中拉伸振動，對藻吸附具有特殊意義［24］。峰值為1 153.89 cm-1的是C-O-C基團，峰值為1 080.14 cm-1的基團主要是 P-O-C基團［23］。特別值得注意的是峰值為879.25 cm-1的特征峰在吸附前十分明顯，而吸附后變得平滑，處在該值的特征峰主要為磷酸鹽或磷基基團［25］，這一變化說明金屬離子與官能團有很強的結合能力，導致吸附后官能團的掩蔽。該變化說明磷基基團參與吸附反應。通過分析峰值的變化，確定微藻在吸附Pb2+過程中主要起作用的官能團包括：OH、C=O、CH、CH2、P=O、PO3-4、PO4，其中磷基基團 PO4、P=O和磷酸鹽（PO3-4）均只出現在含磷培養基中培養的微藻表面，對提高吸附能力具有重要意義［24］。

2.3.2 電位滴定

經自動電位滴定儀測定的酸堿滴定數據通過ProtoFit軟件模擬匯總于表4中。文獻表明，羧基、羥基、氨基、磷基基團的pKa值分別為3～6，8～12，氨基的pKa值為8.6～9.0，磷基基團的pKa值為5.6～7.2［26］，本實驗中得到的 pK1、pK2、pK3、pK4分別對應羧基、磷基、氨基和羥基官能團。由表4可以得知，不同培養條件下微藻的磷基官能團濃度存在顯著差異，特別是B-160的磷酸化官能團，其濃度最高，達到3.25 mol/kg，并且官能團總數的提高也是吸附能力增強的關鍵，由表4可以看出，B-160所具有的官能團總數最多。此外，根據上述FT-IR的結果可知，磷基官能團在吸附前后特征峰變化最大，這充分說明了磷基官能團在微藻吸附重金屬離子的過程中起著主要作用。

3 結 論

（1）提高培養基中的磷濃度有助于提高微藻的生物量，本實驗中最適磷濃度為160 mg/L，生長第8 d的生物量可達1 117.26 mg/L。

（2）在最適pH=6條件下，高載磷藻B-160對Pb2+的去除率最高，達到91.59%。

（3）含磷基團參與并主導微藻對Pb2+的吸附，磷能調控改性微藻表面磷，強化微藻對金屬離子的吸附能力。在160 mg/L的磷濃度改性的條件下，藻對Pb2+的最大吸附量最高，達到7.93 mg/g。