微孔式數(shù)字PCR熒光芯片的自動(dòng)對(duì)焦

朱文艷，周連群，張芷齊，李金澤，李龍輝，4，高 旭，李樹(shù)力，5，郭 振*，姚 佳，3*

(1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；2.中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215163；3.蘇州大學(xué) 電子信息學(xué)院，江蘇 蘇州 215006；4.長(zhǎng)春理工大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；5.上海大學(xué) 通信與信息工程學(xué)院，上海 200444)

1 引 言

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(Digital Polymerase Chain Reaction，dPCR)是一種測(cè)量靶DNA絕對(duì)拷貝數(shù)的獨(dú)特方法，是一種絕對(duì)定量技術(shù)，最早由Saiki等發(fā)表[1-2]，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR)相比，dPCR已被證明具有更高的靈敏度，精度及重復(fù)性[3-5]。從擴(kuò)增后的dPCR芯片中獲取到有用的信息依賴于dPCR檢測(cè)分析系統(tǒng)，如進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[6]，人類乳腺癌中HER2癌基因的檢測(cè)[7]等。目前，dPCR熒光信息的檢測(cè)方式主要包括兩種：一是熒光成像，二是流式細(xì)胞熒光分選[8-9]。熒光成像技術(shù)隨著相機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展，其成像速度越來(lái)越快，分辨率也越來(lái)越高，這種成像方式在顯微成像中得到越來(lái)越廣泛地應(yīng)用[10-12]。

熒光成像技術(shù)易存在失焦的問(wèn)題，針對(duì)微孔式數(shù)字PCR信息統(tǒng)計(jì)對(duì)于高質(zhì)量熒光圖像的需求，若圖像離焦問(wèn)題嚴(yán)重，則會(huì)影響統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。不同樣本之間垂直位置的差異性，導(dǎo)致相機(jī)獲得的圖像呈現(xiàn)不同程度的模糊，因此，對(duì)焦在光學(xué)視覺(jué)成像系統(tǒng)中起著重要作用，例如各類相機(jī)、掃描儀、顯微鏡[13-14]。而自動(dòng)對(duì)焦可以在最少的人工干預(yù)下獲得清晰圖像[15-16]，進(jìn)而獲得準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。為快速獲取清晰的圖像以便于后續(xù)數(shù)據(jù)處理得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，必須根據(jù)樣品變化動(dòng)態(tài)的改變樣品與物鏡或物鏡與成像面之間的距離，以實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)對(duì)焦[17]。

自動(dòng)對(duì)焦可以通過(guò)主動(dòng)、被動(dòng)或者兩者混合來(lái)實(shí)現(xiàn)[17-19]。主動(dòng)方法一般是通過(guò)激光等測(cè)距工具來(lái)測(cè)量離焦距離后進(jìn)行對(duì)焦，需要在系統(tǒng)中額外嵌入測(cè)距系統(tǒng)，并且當(dāng)使用激光時(shí)，會(huì)造成芯片上的熒光基團(tuán)淬滅[20]，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性造成影響。被動(dòng)方法可以分為相位檢測(cè)法和對(duì)比度檢測(cè)法，前者通過(guò)測(cè)量?jī)煞鶊D像之間的相位差來(lái)估計(jì)聚焦位置，依賴于特殊的傳感器檢測(cè)系統(tǒng)[21]；后者計(jì)算每一幀的清晰度以尋找最佳位置，無(wú)需額外檢測(cè)附件，精簡(jiǎn)整體系統(tǒng)，降低成本[22-23]，但搜索每一幀并計(jì)算，明顯增加了計(jì)算量和搜索步驟，進(jìn)而造成對(duì)焦時(shí)間延長(zhǎng)。

考慮到微孔式數(shù)字PCR芯片弱熒光樣本分布差異造成其計(jì)算對(duì)象存在片內(nèi)差異與片間差異，若對(duì)焦方法不當(dāng)，熒光基團(tuán)長(zhǎng)時(shí)間暴露在激發(fā)光下會(huì)發(fā)生淬滅，影響后續(xù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。為了實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確對(duì)焦，本文基于數(shù)字PCR芯片多個(gè)排列孔的特征，提出了一種新的對(duì)焦算法，單曲線擬合函數(shù)法。通過(guò)計(jì)算包含單個(gè)孔的區(qū)域內(nèi)大于閾值的像素的個(gè)數(shù)，得到隨離焦距離變化，其像素?cái)?shù)變化的曲線。在這里，閾值隨圖像平均灰度的變化而變化，從而得到一條與圖像灰度無(wú)關(guān)的像素?cái)?shù)隨離焦距離變化曲線，通過(guò)正弦函數(shù)擬合得到該曲線的擬合函數(shù)，即為微孔式數(shù)字PCR芯片的對(duì)焦評(píng)價(jià)算法。通過(guò)該對(duì)焦算法，可以快速得到離焦圖像的離焦距離與離焦方向，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確對(duì)焦。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 光學(xué)成像系統(tǒng)

自動(dòng)調(diào)焦的目的是通過(guò)對(duì)光學(xué)成像系統(tǒng)的不斷校正，使其能夠?qū)δ繕?biāo)清晰成像，為后續(xù)的圖像處理、信息提取提供紋理豐富、畫(huà)面清晰的圖像。對(duì)于不同結(jié)構(gòu)的任何光學(xué)成像系統(tǒng)，其成像原理基本一致，如圖1所示(彩圖見(jiàn)期刊電子版)。OP和IP分別表示物平面和像平面，D為透鏡直徑，R為模糊圓半徑，u為物距，v為圖像距離，s為透鏡到圖像檢測(cè)器平面上的距離。黃實(shí)線和藍(lán)虛線表示成像對(duì)象不同物距的聚焦結(jié)果。

根據(jù)幾何光學(xué)原理，物距u、像距v與焦距f滿足高斯成像公式，如式(1)：

(1)

由高斯成像公式可知，對(duì)于固定焦距的成像系統(tǒng)，物空間任意物距的目標(biāo)點(diǎn)在像空間存在唯一確定的點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)。當(dāng)目標(biāo)離焦時(shí)，目標(biāo)點(diǎn)在圖像探測(cè)器上的像不再是清晰的點(diǎn)，而是一個(gè)半徑為R的彌散圓。結(jié)合光學(xué)系統(tǒng)的成像模型，根據(jù)三角形相似原理可以得到光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)與彌散圓半徑的關(guān)系式滿足式(2)[24]：

(2)

根據(jù)式(1)和式(2)可得彌散圓半徑R的具體值為式(3)：

(3)

根據(jù)式(3)，當(dāng)s=v時(shí)，彌散斑半徑R=0，物點(diǎn)OP在圖像探測(cè)器上的像為理想的像點(diǎn)；當(dāng)s≠v時(shí)，則有R≠0，物點(diǎn)OP在圖像探測(cè)器上的像便不再是一個(gè)理想的點(diǎn)，而是一個(gè)半徑為R的彌散斑，即產(chǎn)生離焦圖像。

圖1 透鏡光學(xué)成像模型。Fig.1 Lens optical imaging model

彌散斑亮度分布可以通過(guò)簡(jiǎn)單的圓盤(pán)模型來(lái)近似[25]，如式(4)所示：

(4)

其中R是彌散斑半徑。

傳統(tǒng)的成像理論認(rèn)為，固定對(duì)象成像的綜合強(qiáng)度應(yīng)與聚焦無(wú)關(guān)[26-27]。因此，圖像離焦是一個(gè)彌散斑半徑逐漸變大，亮度分散的過(guò)程，擁有高亮度的像素?cái)?shù)也逐漸減少，表現(xiàn)為亮度分布逐漸呈現(xiàn)均勻性，若灰度閾值選取得當(dāng)，離焦過(guò)程中，大于該閾值的像素?cái)?shù)逐漸增大，而在準(zhǔn)焦時(shí)取得最小 值。

(a)微孔陣列芯片(a)Microarray chip

(b)芯片部分放大圖(b)Enlarged image圖2 數(shù)字PCR系統(tǒng)的成像對(duì)象Fig.2 Imaging objects of the digital PCR system

在本文中，系統(tǒng)的成像對(duì)象是完成進(jìn)樣及封裝的微孔陣列芯片，芯片上規(guī)則排列的微孔，將稀釋的dPCR樣本溶液分割，一部分微孔內(nèi)填充有DNA樣本，引物及特異性的熒光探針，DNA每擴(kuò)增一條DNA鏈，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)熒光分子。經(jīng)過(guò)熱循環(huán)的芯片在激光激發(fā)的作用下，熒光分子累積的孔呈現(xiàn)高亮度，其他孔亮度則無(wú)較大區(qū)別。如圖2所示，芯片內(nèi)灰度差異的存在及芯片間灰度差異的存在，使得傳統(tǒng)的根據(jù)像素灰度梯度差來(lái)評(píng)價(jià)離焦量的自動(dòng)對(duì)焦體系出現(xiàn)了片內(nèi)差異及片間差異，這就要求其計(jì)算窗口需要盡可能大以減少這種誤差，從而增加了計(jì)算量。

采用包含單孔的一定區(qū)域內(nèi)，大于某一閾值像素?cái)?shù)量的變化曲線對(duì)焦評(píng)價(jià)算法，其計(jì)算對(duì)象為單孔及其附近區(qū)域，在保證對(duì)焦精度的條件下，可以選擇很小的對(duì)焦窗口，只需包含單孔及其附近區(qū)域，從而減小計(jì)算量。因此，該對(duì)焦算法理論上可以實(shí)現(xiàn)微孔式數(shù)字PCR芯片的準(zhǔn)確快速對(duì)焦。

3 大于閾值的像素?cái)?shù)量的調(diào)焦算法

3.1 自適應(yīng)對(duì)焦窗口的選取

對(duì)焦窗口是在自動(dòng)對(duì)焦過(guò)程中利用評(píng)價(jià)函數(shù)對(duì)拍攝場(chǎng)景進(jìn)行清晰度評(píng)價(jià)所選取的某一區(qū)域，通常為人們所感興趣的區(qū)域(Region-of-interest，ROI)，而非對(duì)整幅圖像進(jìn)行計(jì)算。對(duì)焦窗口的選擇影響對(duì)焦精度和速度[18]。窗口太大則包含過(guò)多背景對(duì)象，導(dǎo)致數(shù)據(jù)冗余，從而增加計(jì)算負(fù)載；窗口選擇太小，可能丟失關(guān)注對(duì)象的部分?jǐn)?shù)據(jù)，因而合適的對(duì)焦窗口對(duì)完成快速對(duì)焦很重要。

常用的窗口選擇算法有，中央?yún)^(qū)域?qū)勾翱谶x擇法[28]、多區(qū)域?qū)勾翱谶x擇法、非均勻采樣對(duì)焦窗口選擇法等[29]。這些方法在一定程度上節(jié)省了計(jì)算時(shí)間，在一些領(lǐng)域具有實(shí)用價(jià)值，但這些方法一旦選定區(qū)域后，對(duì)焦窗口就固定不變，面對(duì)不同的對(duì)焦對(duì)象及對(duì)焦過(guò)程中出現(xiàn)的物體偏移情況無(wú)法做出有效應(yīng)對(duì)，所以需要根據(jù)對(duì)焦對(duì)象及離焦距離的不同自適應(yīng)選取對(duì)焦窗口以提高對(duì)焦精度。

圖3 自適應(yīng)窗口選擇流程圖Fig.3 Adaptive window selects flowchart

基于大于灰度閾值像素?cái)?shù)量的自動(dòng)調(diào)焦算法選取對(duì)焦對(duì)象的步驟為：首先選取視野中心31×31 pixel區(qū)域，在該區(qū)域中尋找與截取圖像邊沿相差6 pixel的第一個(gè)質(zhì)心點(diǎn)；以第一個(gè)質(zhì)心點(diǎn)為中心取周圍13×13 pixel的區(qū)域?yàn)閷?duì)焦窗口；然后所計(jì)算該區(qū)域的閾值及評(píng)價(jià)值，獲得離焦數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)焦后將會(huì)判斷是否完成對(duì)焦。若是，則結(jié)束，若否，則在下一次對(duì)焦前再進(jìn)行一次窗口選取步驟，進(jìn)而做到自適應(yīng)窗口選取。根據(jù)不同對(duì)焦對(duì)象自適應(yīng)選取對(duì)焦孔的步驟如圖3所示。

3.2 基于最值的自動(dòng)閾值選取

判斷閾值的選取關(guān)系到對(duì)焦準(zhǔn)確度，同時(shí)又要隨樣本的改變而自動(dòng)變化，才能達(dá)到自動(dòng)準(zhǔn)確對(duì)焦的目的。文中根據(jù)對(duì)焦對(duì)象的特征提出了基于區(qū)域最值的自動(dòng)閾值選取方法，在跟隨樣本變化的同時(shí)，能夠做到準(zhǔn)確對(duì)焦。

在對(duì)焦區(qū)域內(nèi)，根據(jù)區(qū)域內(nèi)的最大值與最小值變化曲線可知，其最值的和在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定的值，這個(gè)穩(wěn)定的值除以一個(gè)經(jīng)統(tǒng)計(jì)后得出的固定的系數(shù)，即為所取閾值如式(5)：

T={max(Iout(x，y，zr))+min(Iout(x，y，zr))}/2.5，

(5)

其中：T表示所取閾值，Iout表示樣本I在zr處的離焦圖像。

閾值T隨對(duì)焦對(duì)象的亮度增大或減小，提供了一個(gè)具有普適性的閾值選取辦法，同時(shí)為下面的評(píng)價(jià)算法的提出奠定了基礎(chǔ)。如圖4所示，x軸表示圖像位置的變化，y軸表示灰度最值的變化。紅色表示maxI，黃色表示minI，藍(lán)色表示(maxI+minI)/2.5(彩圖見(jiàn)期刊電子版)。

圖4 灰度最值曲線及閾值曲線Fig.4 Gray minimum and maxmum curve and threshold curve

3.3 大于自動(dòng)閾值的像素?cái)?shù)量變化評(píng)價(jià)算法

依據(jù)對(duì)焦窗口的選取及閾值的選取，通過(guò)統(tǒng)計(jì)對(duì)焦窗口內(nèi)大于閾值像素點(diǎn)數(shù)量的變化，得到對(duì)焦評(píng)價(jià)曲線。

在離焦到正焦再到離焦的序列圖像中，圖像的離焦量越小，彌散斑半徑越小，亮度越集中，大于某一閾值的像素?cái)?shù)量值達(dá)到最小，如圖5所示。x軸表示樣本的位置，y軸表示像素?cái)?shù)的變化。

圖5 窗口內(nèi)大于閾值的像素?cái)?shù)隨位置變化曲線及A，B，C，3點(diǎn)位置對(duì)應(yīng)的微觀孔的圖像

傳統(tǒng)的搜索方法通常根據(jù)一些自定義的規(guī)則來(lái)尋找最高峰，本文通過(guò)對(duì)不同芯片對(duì)焦窗口中不同灰度級(jí)像素的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到三組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。如圖6所示，組圖左側(cè)給出了對(duì)焦窗口內(nèi)像素灰度最大值，最小值以及閾值的變化曲線，根據(jù)閾值的取值得到對(duì)焦窗口內(nèi)大于閾值的像素?cái)?shù)量的變化散點(diǎn)圖，根據(jù)散點(diǎn)圖的變化趨勢(shì)擬合出了變化曲線。

(a)第一組(a)First group

(b)第二組(b)Second group

(c)第三組(c)Third group

從3組灰度變化曲線可知，3個(gè)樣本芯片的灰度最值及閾值選取的大小并不相同。但從像素?cái)?shù)量變化散點(diǎn)圖及其正弦擬合曲線的變化趨勢(shì)來(lái)說(shuō)，在此閾值的選取方法下，3組像素?cái)?shù)量變化曲線在突變區(qū)間橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)的差值大小，平穩(wěn)區(qū)間的縱坐標(biāo)的大小上具有一定的一致性。

(a)散點(diǎn)圖

(b)擬合曲線

根據(jù)分組圖中，大于閾值的像素?cái)?shù)量變化趨勢(shì)的一致性，在同一圖中做出像素?cái)?shù)量隨離焦距離的變化散點(diǎn)圖及其擬合曲線[30]，如圖7所示。

3組數(shù)據(jù)中，像素?cái)?shù)量隨離焦距離的變化趨勢(shì)主要表現(xiàn)為2個(gè)特征：一是在一定離焦距離范圍內(nèi)，對(duì)于不同灰度的樣本芯片，其像素?cái)?shù)隨離焦距離的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)高度的一致性，擬合曲線符合四參數(shù)正弦擬合曲線的變化特征[31-32]；二是，在上述離焦距離范圍之外，對(duì)于不同灰度的樣本芯片，其像素?cái)?shù)量穩(wěn)定在169，即對(duì)焦窗口所包含的總的像素?cái)?shù)。這兩個(gè)特征符合光學(xué)成像原理所述的彌散斑半徑及亮度分布特征，可用分段函數(shù)表示為：

(6)

其中：d表示離焦距離，參數(shù)a，b，c表示擬合曲線的參數(shù)。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，方差R-square為0.944條件下，a，b，c的取值如表1。

曲線的d，f取值只與離焦距離，大于閾值的像素?cái)?shù)有關(guān)，在窗口和閾值確定的條件下，可認(rèn)為曲線的變化特征唯一確定。因此，在計(jì)算得出大于閾值的像素?cái)?shù)后，可根據(jù)擬合曲線來(lái)計(jì)算離焦距離與方向。根據(jù)像素?cái)?shù)反推出的數(shù)字的絕對(duì)值代表離焦距離，正負(fù)代表方向，為正時(shí)，代表取相位置在準(zhǔn)焦點(diǎn)位置的下方，應(yīng)向上運(yùn)動(dòng)；為負(fù)時(shí)，代表取相位置在準(zhǔn)焦點(diǎn)位置的上方，應(yīng)向下運(yùn)動(dòng)。

表1 擬合曲線系數(shù)

(a)f1(d)>f2(d)>f3(d)

(b)f1(d)>f3(d)>f2(d)

(c)f3(d)>f2(d)>f1(d)

(d)f1(d)>f3(d)>f2(d)圖8 根據(jù)3個(gè)位置像素?cái)?shù)值分布情況進(jìn)行方向判斷Fig.8 Judging the direction according to the distribution of the number of pixels in 3 locations

4 結(jié)果與分析

為了評(píng)估所提出方法的有效性和效率，本文對(duì)3張新的芯片進(jìn)行測(cè)試，每張芯片采集A，B，C共3組不同初始位置的數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)包含3個(gè)等間隔位置的圖像。通過(guò)計(jì)算每個(gè)位置圖像上大于閾值的像素個(gè)數(shù)，來(lái)計(jì)算離焦距離和進(jìn)行離焦方向的判斷，結(jié)果如表2～表4，圖9～圖11。此外，每張芯片在離焦到正焦再到離焦的過(guò)程中都均勻的提取了600張圖像，對(duì)每組的600張圖片進(jìn)行處理，并利用清晰度計(jì)算方法對(duì)每組圖像進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)，做出清晰度評(píng)價(jià)值擬合曲線，選取曲線的最值對(duì)應(yīng)的位置作為準(zhǔn)焦點(diǎn)位置，進(jìn)而計(jì)算出每個(gè)初始位置的實(shí)際離焦距離。

表2、表3、表4中分別統(tǒng)計(jì)了每張芯片的灰度及每個(gè)位置的計(jì)算離焦信息，并與實(shí)際離焦信息進(jìn)行對(duì)比，得出對(duì)焦誤差，該誤差反映到實(shí)際圖像上，即為圖9、圖10、圖11。

表2 第一張芯片測(cè)試數(shù)據(jù)

圖中Initial列是芯片位于初始位置時(shí)整幅芯片圖像及5個(gè)區(qū)域微觀圖，A，B，C組分別代表3個(gè)初始圖像；Autofocus列是對(duì)焦后整幅芯片圖像及5個(gè)區(qū)域微觀圖，A，B，C組分別代表3幅對(duì)焦后圖像；Focus right，即D組是準(zhǔn)焦點(diǎn)整幅芯片圖像及5個(gè)區(qū)域的微觀圖，圖中的紅色方框代表截取的圖像在整幅芯片圖像中所處位置。

Autofocus列的A，B，C三組圖像中，孔與孔之間已經(jīng)可以明顯分辨。經(jīng)過(guò)與準(zhǔn)焦點(diǎn)的D組圖像對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在肉眼觀察條件下，并不能清晰判別幾幅圖像之間的差異。在預(yù)設(shè)清晰度條件下，所有對(duì)焦測(cè)試結(jié)果已滿足后續(xù)計(jì)算要求，經(jīng)過(guò)測(cè)試，目前所界定的清晰地范圍為準(zhǔn)焦點(diǎn)上下15個(gè)位置。

圖9 第一張芯片準(zhǔn)焦圖像與3組對(duì)焦前后圖像Fig.9 First chip quasi-focal image and three groups of pre-and post-focal images

表3 第二張芯片測(cè)試數(shù)據(jù)

圖10 第二張芯片準(zhǔn)焦圖像與3組對(duì)焦前后圖像Fig.10 Second chip quasi-focal image and three groups of pre-and post-focal images

表4 第三張芯片測(cè)試數(shù)據(jù)

圖11 第三張芯片準(zhǔn)焦圖像與3組對(duì)焦前后圖像Fig.11 Third chip quasi-focal image and three groups of pre-and post-focal images

以速度和準(zhǔn)確性為標(biāo)準(zhǔn)，在同等初始條件下，與傳統(tǒng)的爬山算法進(jìn)行比較(各類爬山算法的區(qū)別主要在于步長(zhǎng)與精度的選擇上，但是基本思想是相同的)。Hen等[33]提出粗細(xì)結(jié)合的對(duì)焦方法，該方法采用粗略或較大步距找到一個(gè)峰值，然后反轉(zhuǎn)方向采用精細(xì)或較小步距來(lái)縮小范圍。峰和反轉(zhuǎn)方向、停止搜索的條件是手動(dòng)創(chuàng)建的，不同研究者給與的峰和反向以及停止搜索的條件是不同的。在這里，根據(jù)對(duì)象創(chuàng)建的搜索條件是，粗搜索步距，20個(gè)位置差，較為精細(xì)搜索，10個(gè)位置差，初始搜索方向定位向上搜索，搜索到峰值即停止搜索，對(duì)焦過(guò)程中，每運(yùn)動(dòng)一步均需要重新取相計(jì)算，直到完成對(duì)焦。假設(shè)使用兩種不同的算法在相同的初始位置對(duì)同一樣本進(jìn)行對(duì)焦，并且電機(jī)驅(qū)動(dòng)位移臺(tái)進(jìn)行相同的勻速運(yùn)動(dòng)，以此忽略多次啟停造成的時(shí)間延長(zhǎng)，則在對(duì)焦過(guò)程中耗費(fèi)時(shí)間的動(dòng)作集中在取相計(jì)算上，當(dāng)對(duì)焦所需步驟數(shù)越多，重復(fù)取相與計(jì)算次數(shù)越多，整體上對(duì)焦耗時(shí)越多。若不忽略多次啟停造成的時(shí)間延長(zhǎng)，則步驟數(shù)越多，啟停引起的時(shí)耗越多。因此，文中以所需步驟數(shù)的多少的來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)焦過(guò)程的快慢[34-35]，對(duì)傳統(tǒng)爬山搜索算法和本文中所提算法對(duì)焦過(guò)程中所需步驟數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。文中所提方法完成對(duì)焦僅需4步，與傳統(tǒng)爬山算法相比，步驟數(shù)明顯減少，并在表5中做出統(tǒng)計(jì)。

同時(shí)，爬山完成所需步驟數(shù)明顯與芯片的初始位置以及初始運(yùn)動(dòng)方向的設(shè)定有關(guān)。當(dāng)設(shè)定初始方向?yàn)橄蛏希酒跏嘉恢梦挥诮裹c(diǎn)以下比初始位置位于焦點(diǎn)以上對(duì)焦步驟數(shù)明顯減少，原因是少了第三次取相后的換向過(guò)程。另外，若爬山步距設(shè)置較小，并且評(píng)價(jià)函數(shù)選取不恰當(dāng)，搜索過(guò)

程中很容易陷入局部極值，在未到達(dá)峰值點(diǎn)的情況下就退出搜索，對(duì)焦過(guò)程中斷。

表5 不同對(duì)焦方法所需步驟數(shù)對(duì)比

5 結(jié) 論

以上研究表明，一定區(qū)域內(nèi)，通過(guò)灰度大于閾值的像素?cái)?shù)變化曲線作為微孔式數(shù)字PCR芯片的自動(dòng)對(duì)焦算法是可行的。利用對(duì)焦窗口和判斷閾值的自適應(yīng)選取，統(tǒng)計(jì)窗口內(nèi)大于閾值的像素?cái)?shù)，并得出其隨離焦距離變化的特征擬合曲線以及曲線的函數(shù)表達(dá)式，該函數(shù)在后續(xù)測(cè)試中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)焦。該方法不受灰度變化的影響，與混合爬山對(duì)焦方法相比，對(duì)焦步驟數(shù)最少減少了33.3%，最多減少了66.7%，平均減少了51.89%，實(shí)現(xiàn)了微孔式數(shù)字PCR芯片微尺度陣列單元的準(zhǔn)確快速對(duì)焦，在最大程度上減少熒光曝光時(shí)間，進(jìn)而減少熒光的淬滅，為后續(xù)計(jì)算提供更為原始而準(zhǔn)確的圖像。