梭梭根際枯草芽孢桿菌WM13- 24對多年來黑麥草耐鹽性的影響

姚 丹,牛舒琪,趙 祺,曹 靖,韓慶慶,李慧萍,緱晶毅,張金林,*

1 蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室草地微生物研究中心, 蘭州 730020 2 農業農村部草牧業創新重點實驗室,草地農業教育部工程研究中心,蘭州大學草地農業科技學院, 蘭州 730020

土壤鹽漬化是降低植物生產力、制約農業發展的主要非生物脅迫因素之一[1]。全球大約10億hm2的土壤受到鹽漬化的威脅,中國鹽漬化土地約占全球鹽漬土面積的1/10[2]。鹽脅迫對植物的影響主要有：鹽離子毒害、減弱植物吸水能力、產生氧化脅迫、使葉片膨脹受損并誘導氣孔關閉和降低光合能力等,從而降低其生物量和繁殖成功率,阻礙農業生產的發展[2- 5]。土壤鹽漬化導致可用土地面積大量減少,土地可利用率降低,生產成本增加,成為可持續農業生態系統發展的一個重大問題。

由于土壤鹽漬化進程的加快和草地灌溉中污水使用量的增加,在許多地區草坪草受到土壤鹽堿化影響的程度日益加深[6]。多年生黑麥草(Loliumperenne)是我國廣為應用的一種冷季型草坪草,分蘗能力強,生長迅速,覆蓋力強,品質優良,適應范圍廣,因此常作為建植草坪草地的先鋒草種[7- 8]。同時,多年生黑麥草也是一種品質優良的經濟牧草,莖葉繁茂,幼嫩多汁,產草量高,再生性強,為各種家畜所喜食,在我國南方地區廣為栽培[9- 10]。多年生黑麥草對高溫、寒冷和干旱環境都有一定的適應性,但當其生長環境鹽分過高時,生長明顯受到抑制,在商業栽培品種中其耐鹽性僅為中等水平[11- 12]。因此,研究如何提高多年生黑麥草的耐鹽性,對草坪建植和農牧業生產的發展具有重要意義。

研究發現,一些定殖于植物根際的土壤細菌具有促進植物生長、減少植物病害發生率以及提高植物抗脅迫能力的特點,Kloepper和Schroth 于1978年將此類細菌命名為根際細菌,1981年又將這類具有促生作用的根際細菌正式命名為根際促生細菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR)[13-15]。研究表明,PGPR可以通過直接作用和間接作用兩大機制提高植物生產力,直接作用包括提高植物對營養元素的生物可得性和影響植物激素的濃度,如溶磷,生物固氮,產生吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素和乙烯等小分子,生成鐵載體和1-氨基環丙烷- 1-羧酸(ACC)脫氨酶等;間接作用包括干擾群體感應信號和抑制生物膜的形成,發揮抗真菌活性,誘導系統抗性,促進微生物和植物共生,產生干擾病原體毒素的等,從而調控植物的生長發育[16- 18]。

分布于我國新疆、甘肅西部、寧夏西北部、青海北部、內蒙古的梭梭(Haloxylonammodendron),是藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬多年生灌木或小喬木,由于其具有較強的抗旱耐鹽性,已成為我國多個沙漠地區植被恢復的重要樹種。梭梭具有強大的根系,垂直根系一般深為5 m,水平根系伸展可達10 m,且其具有較強的根際正效應,據此推測其根系可以為PGPR提供一個獨特的棲息地,從而幫助其適應極端環境[19- 21]。因此,把目光聚焦在梭梭根際促生細菌上,研究其對多年生黑麥草的接種效應,以期為新型草坪草微生物菌肥的開發提供理論依據。

課題組前期分別從內蒙古阿拉善右旗(巴丹吉林沙漠)和甘肅民勤(騰格里沙漠)不同生長時期的梭梭根際土壤中分離純化獲得293株細菌,發現多株具有PGPR特性。前期預實驗結果表明,一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株WM13- 24對模式植物擬南芥具有明顯的促生作用,本研究將菌株WM13- 24接種于多年生黑麥草,研究其對黑麥草幼苗生長及耐鹽性調控的生理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌菌株WM13- 24 (16S rRNA基因序列在GenBank的注冊號為MN582985)分離于冬季甘肅民勤騰格里沙漠的13年樹齡梭梭根際土壤,陽性參考菌株枯草芽孢桿菌GB03由美國德州理工大學Paul W. Paré 教授提供,陰性對照大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) DH5ɑ購自中國大連Takara生物技術有限公司,多年生黑麥草種子“紳士”(Loliumperenne‘Esquire’)由北京綠冠種業發展有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1菌液的制備及處理

LB液體培養基以10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母粉的比例配制,使用標準型pH計(PB- 10,北京賽多利斯)調節pH至7.2;將立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX- 50KBS,上海申安)溫度調至121℃對培養基進行高溫滅菌20 min;待其冷卻后,在超凈工作臺上加入菌液,每100 mL的LB液體培養基分別添加100 μL的WM13- 24、GB03和DH5ɑ菌液;接著在28℃、轉速180 r/min條件下的恒溫培養搖床(THZ- 300,上海一恒科技)中培養過夜;使用紫外可見分光光度計(V- 5800型)測定菌液濃度,調節濃度至OD600=0.90時取出備用。

1.2.2幼苗培養

實驗采用盆栽,每盆裝有高溫滅菌(烘箱80℃滅菌8 h)的細沙和蛭石(體積比1∶1)共1500 g。每盆混合土中加入上述濃度調節至OD600=0.90的菌液10 mL,空白對照加入LB液體培養基10 mL,攪拌混勻后每盆均勻播種1.5 g黑麥草種子。待幼苗生長7 d后,對其進行間苗處理,每盆保留10株生長一致的幼苗。幼苗繼續生長20 d后,往各對照組和處理組每株幼苗補接種上述菌液1 mL,并添加不同鹽濃度(0, 150, 300 mmol/L NaCl)的1/2 Hoagland營養液,在鹽處理2周后測定相關生理數據。

1.3 生長生理指標測定

分別取各處理的幼苗,沖洗干凈植物表面的灰塵,使用稱重法稱取地上部鮮重,用直尺直接測量根長,再將稱過重量的樣品烘至恒重后稱取干重。用乙醇丙酮混合液浸提法測定葉綠素含量;用TTC(氯化三苯基四氮唑)法測定幼苗根系活力;用DDS- 11C型電導儀測定電導率,以相對電導率表示細胞膜相對透性;使用冰點滲透儀(OSMOMAT- 030, Germany)測定滲透勢;采用蒽酮比色法對可溶性糖含量進行測定;使用脯氨酸(Pro)含量測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定脯氨酸含量;使用過氧化氫酶(CAT)活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定過氧化氫酶(CAT)活性;采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)的含量(表1)。

將待測幼苗地上部烘干搗碎后放入試管,添加100 mmol/L濃度的冰乙酸10 mL,密封置于90℃水浴鍋中反應2 h,待其冷卻至室溫,然后過濾,用火焰分光光度計(Sher wood 410)測定吸光值,最后結合標準曲線分別計算Na+、K+離子含量 (mmol/gDW) (表1)。

1.4 數據處理

每個處理設置12個重復,所有圖中的數值為平均值± SE;數據使用Excel 2010作圖,中文版SPSS 17.0 (美國伊利諾斯州芝加哥SPSS公司)進行差異顯著性分析(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下WM13- 24對黑麥草生長的影響

圖1 鹽脅迫下根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗生長和地上部生物量的影響Fig.1 Effects of the PGPR strains on growth and shoot biomass of perennial ryegrass under salt treatmentsFW：鮮重,Fresh weight;DW：干重,Dry weight

正常條件下,接種根際促生細菌的黑麥草幼苗根系長勢優于LB空白對照和DH5α陰性對照,尤其是菌株WM13- 24處理的幼苗側根發育顯著優于其他處理;150 mmol/L NaCl處理2周時,接種根際促生細菌的幼苗地上部和根系生長均顯著優于空白與陰性對照;300 mmol/L NaCl處理2周時,根際促生細菌處理的幼苗與空白和陰性對照比較,根系更為發達,分蘗數更多(圖1)。150 mmol/L NaCl處理2周時,菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗地上部鮮重與空白對照相比提高了19.79%和24.09%,干重分別增加了24.18%和顯著提高了36.11% (P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時,鮮重分別顯著提高33.42%和45.05% (P<0.05),干重提高11.17%和14.85% (圖1)。

150 mmol/L NaCl處理2周時,接種根際促生細菌提高了幼苗的葉綠素含量,尤其是WM13- 24處理的幼苗,與空白對照相比,其葉綠素a和葉綠素b分別顯著增加了44.05%和53.79% (P<0.05),GB03處理的幼苗分別增加了18.56%和16.71%;300 mmol/L NaCl處理下,GB03和WM13- 24處理的幼苗,其葉綠素a含量分別提高17.81%和17.46%,葉綠素b含量分別提高了33.92%和27.72% (圖2)。

圖2 鹽脅迫下根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of the PGPR strains on chlorophyll content of perennial ryegrass under salt treatment

150 mmol/L NaCl處理2周時, 與空白對照相比,GB03和WM13- 24處理的幼苗根長分別顯著提高了48.50%和69.21% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時,與空白對照相比,GB03處理的幼苗根長提高了9.58%,WM13- 24處理組顯著提高了24.07% (P<0.05)。其中WM13- 24處理對根長的促進效果更佳,150和300 mmol/L NaCl處理下,WM13- 24處理下幼苗根長與GB03處理相比分別顯著提高了13.94%和13.22% (P<0.05) (圖3)。

圖3 鹽脅迫下根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗根長和根系活力的影響Fig.3 Effects of the PGPR strains on root length and root vigour of perennial ryegrass under salt treatments

鹽處理2周時,正常生長條件下,GB03和WM13- 24處理的黑麥草幼苗的根系活力與空白對照相比提高了19.99%和16.16%。150 mmol/L NaCl處理2周時,GB03和WM13- 24處理的幼苗根系活力與空白對照相比分別顯著提高了48.28%和49.47% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時,分別顯著提高了47.92%和58.48% (P<0.05) (圖3)。

圖4 鹽脅迫下根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effects of the PGPR strains on CAT activity of perennial ryegrass under salt treatments CAT：過氧化氫酶,Catalase

2.2 鹽脅迫下WM13- 24對黑麥草質膜完整性的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時,與空白對照組相比,菌株GB03處理的幼苗過氧化氫酶活性提高了45.71%,WM13- 24處理的顯著提高了87.90% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,與空白對照相比,GB03 和WM13- 24處理組分別顯著提高氧化氫酶活性47.51%和64.21% (P<0.05) (圖4)。

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時,GB03處理的幼苗相對質膜透性與空白對照組相比降低了31.65%,WM13- 24顯著降低了43.54% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時,GB03和WM13- 24處理與空白對照相比分別顯著降低了23.01%和24.56% (P<0.05) (圖5)。300 mmol/L NaCl處理2周時,GB03和WM13- 24處理的幼苗丙二醛含量與空白對照相比顯著降低了1.22倍和54.24% (P<0.05) (圖5)。

圖5 鹽脅迫下梭梭根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗丙二醛含量和相對質膜透性的影響 Fig.5 Effects of the PGPR strains on MDA content and relative plasma permeability of perennial ryegrass under salt treatmentsRMP：相對質膜透性透性,Relative membrane permeability;MDA：丙二醛,Malondialdehyde

2.3 鹽脅迫下WM13- 24對黑麥草滲透調節能力的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時,菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗可溶性糖含量與空白對照組相比分別提高了42.68%和47.88%;300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,分別顯著提高了1.04倍和84.41% (P<0.05) (圖6)。

圖6 鹽脅迫下梭梭根際促生細菌對多年生黑麥草可溶性糖含量,脯氨酸含量和滲透勢的影響Fig.6 Effects of the PGPR strains on soluble sugar and proline contents and osmotic potential of perennial ryegrass under salt treatments

正常條件下,GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對照組分別顯著提高了58.52%和80.25% (P< 0.05);150 mmol/L NaCl處理2周時,GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對照分別顯著提高了68.81%和1.08倍(P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對照分別顯著提高了48.68%和82.71% (P< 0.05),WM13- 24與GB03處理的幼苗相比,脯氨酸含量顯著提高了22.88% (P< 0.05) (圖6)。

150 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,根際促生細菌處理的幼苗滲透勢均低于空白對照和陰性對照,GB03和WM13- 24處理的幼苗滲透勢與空白對照相比分別降低了26.13%和23.96%;300 mmol/L NaCl處理2周時,分別降低了14.73%和29.08% (圖6)。

2.4 鹽脅迫下WM13- 24對黑麥草Na+和K+含量的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時,用菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗,其地上部的K+含量與空白對照組相比分別提高了13.61%和14.58%,Na+含量降低了34.65%和22.52%,K+/Na+分別提高了52.97%和40.38%;300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,地上部的K+含量分別提高了21.08%和10.80%,Na+含量顯著降低了26.22%和20.17% (P< 0.05),K+/Na+分別提高了59.08%和38.59% (圖7)。

圖7 鹽脅迫下梭梭根際促生細菌對多年生黑麥草幼苗Na+和K+含量的影響 Fig.7 Effects of the PGPR strains on Na+ and K+ content of perennial ryegrass under various salt treatments

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時,菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗根中的K+含量與空白對照組相比分別提高了15.62%和23.18%,Na+含量降低了36.08%和36.67%,K+/Na+分別顯著提高了57.34%和68.35% (P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時,與空白對照相比根中的K+含量分別提高了25.67%和30.53%,Na+含量顯著降低了27.84%和43.97%,K+/Na+分別顯著提高了65.25%和87.93% (P< 0.05) (圖7)。

3 討論與結論

鹽脅迫下植物生長速率變慢,根、莖和葉片生物量顯著下降,生物量一定程度上可反應植株的生長狀況和抵御鹽脅迫的能力[22]。已有的研究表明,接種根際促生菌可促進植物在鹽脅迫下的生長。Chen等[23]發現解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9可通過分泌生長素和赤霉素,促進玉米在鹽脅迫下的生長,也可通過上調參與植物光合作用關鍵基因RBCS和RBCL,維持玉米在鹽脅迫下的光合速率,顯著提高了玉米在鹽脅迫下的生物量。Siddikee等[24- 25]還發現接種根際促生細菌可通過減少鹽脅迫誘導的乙烯從而緩解鹽脅迫對紅辣椒植株生長的抑制作用,鹽脅迫下紅辣椒幼苗的生物量與正常條件下持平。本實驗發現,在150和300 mmol/L NaCl脅迫條件下,接種根際促生細菌均能提高鹽脅迫下黑麥草幼苗地上部生物量,尤其是梭梭根際促生細菌WM13- 24。另外,在150和300 mmol/L NaCl條件下,接種根際促生細菌的幼苗葉綠素a及葉綠素b含量均高于空白對照和陰性對照,并且在150 mmol/L NaCl處理時,與已商業化生產的陽性對照菌株GB03相比,接種WM13- 24能夠更有效的維持黑麥草幼苗葉綠素含量,而葉綠素作為光合作用中的重要參與者,是表征光合利用率最重要的指標之一,葉綠素含量的高低直接影響植物的光合能力[2]。植物葉片作為光合作用的重要部位,在植物生長和抵抗外界脅迫方面起著至關重要的作用,除此之外,根系作為植物吸收水分和營養元素的重要器官,也是反映植物生長和抗逆能力的關鍵器官,白玉娥等[26]提出強壯植物根系是提高植物抗性的一種有效途徑,有研究發現根際促生細菌能夠促進植株根系伸長生長,提高根系活力,從而增強植株攝取營養的能力,最終改善植物在脅迫條件下的生長發育[27]。類似的結果也在本實驗中發現,在鹽脅迫下,WM13- 24促進了黑麥草根的生長,顯著提高了幼苗的根系活力。因此,WM13- 24可能通過提高鹽脅迫下葉綠素含量以維持鹽脅迫下植物的光合作用,也可能通過促進根系的生長,增強植株在脅迫條件下吸收水分和營養物質的能力,從而維持幼苗在鹽脅迫條件下的生長,幫助其更好的適應鹽逆境。

當植物遭受環境脅迫時,膜的結構和功能發生改變,膜滲透性增加,細胞內含物外泄,這種膜變化構成了植物細胞在環境脅迫下的初始響應,所以細胞膜滲透性的變化為評估植物對環境脅迫的耐受力提供了有力證據[28- 29]。在鹽脅迫條件下,接種根際促生細菌的黑麥草幼苗葉片相對質膜透性均低于對照組幼苗,且隨著鹽濃度增加,接種WM13- 24的植株葉片相對質膜透性的上升幅度顯著小于空白和陰性對照組,與陽性對照GB03相比,其在降低植物葉片相對質膜透性方面效果也更具優勢。WM13- 24通過抑制鹽脅迫下黑麥草幼苗膜透性的增加,減少電解質的外滲,從而維持幼苗細胞膜的穩定性,有效緩解鹽脅迫對植株的傷害。

在正常情況下,細胞內活性氧的產生與清除處于一種動態平衡的狀態。但植物在遭受逆境脅迫時,這種平衡遭到破壞,活性氧的積累導致膜脂過氧化,嚴重影響生物膜的功能,造成植株氧化損傷[30- 31]。鹽脅迫下植物體內活性氧的積累是導致鹽害的主要原因之一[32]。Chen等[23]發現,鹽脅迫下,接種解淀粉芽孢桿菌SQR9可通過保護玉米免受因活性氧積累而造成的損傷及滲透脅迫而賦予其耐鹽性。因此,通過改善植物內源性抗氧化系統,及時清除植物體內積累的活性氧,以及降低其滲透勢,可增強其對環境脅迫的耐受性[33]。對活性氧的清除有兩類防御系統,分為酶促和非酶促兩大類,其中酶促類清除劑包括過氧化氫酶(CAT)等[31]。CAT是植物體內重要的保護酶之一,它能清除細胞內過多的活性氧自由基,減少膜質的過氧化,進而保護膜的結構,從而使植物能在一定程度上抵御逆境脅迫,一般認為CAT活性越大,植物的抗逆能力越強,故其活性的高低可以反映植物抗逆性[34]。150 mmol/L NaCl和300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時,與空白對照相比,接種WM13- 24顯著提高了幼苗的CAT活性,進而提高了黑麥草在鹽脅迫條件下對活性氧的清除能力;同樣作為膜質過氧化的指示化合物的丙二醛(MDA),是由鹽脅迫引起的氧化脅迫造成膜損傷的結果,因此,MDA含量可用于反映植物遭受逆境損害的程度[35- 38]。在300 mmol/L NaCl處理2周時,接種根際促生細菌顯著降低了黑麥草幼苗丙二醛含量,說明接種根際細菌可通過提高CAT等清除劑的活性,及時清除植物體內活性氧,從而減少由鹽逆境引起的氧化脅迫對植株的傷害。

外界鹽濃度越高植物所遭受的滲透脅迫強度就越大,對鹽脅迫抗性越強的植物,其滲透勢下降越快[39]。本實驗結果表明鹽脅迫條件下WM13- 24顯著降低了黑麥草幼苗的滲透勢,從而有利于維持植株幼苗在脅迫條件下對水分的吸收。與GB03相比,接種WM13- 24在降低葉片滲透勢方面效果更顯著。滲透調節是植物適應鹽漬等脅迫的主要生理機制之一,植物在遭受滲透脅迫時,植物能夠合成脯氨酸、可溶性糖等有機滲透調節物質來避免細胞脫水以維持細胞膨壓,穩定細胞中酶分子的活性構象,從而保護酶免受鹽離子的傷害[40- 42],同時脯氨酸還可作為自由基的清除劑而保持細胞膜的完整性[43- 44]。本實驗同樣發現,在鹽脅迫條件下接種WM13- 24通過促進黑麥草幼苗體內對脯氨酸和可溶性糖的積累,提高了幼苗滲透調節能力和抵御鹽脅迫的能力。

在鹽脅迫條件下,植株通過控制其體內K+和Na+平衡以保持其正常生長[45]。植物遭受鹽脅迫時,會通過主動吸收的方式從外界吸收并積累較多無機鹽離子,如Na+、K+、Mg2+、Cl-等,以調節滲透勢。鉀是植物生長的必需元素,能夠維持細胞的基本功能,同時保持較低水平的蛋白酶和核酸內切酶活性并防止植物在鹽脅迫下造成的細胞損傷和死亡[46]。細胞質內過多Na+的積累會造成Na+毒害和滲透脅迫,并阻礙植物對K+的吸收,造成K+匱缺,抑制植物體內依賴于K+的生理生化反應同時干擾其他正常生理生化過程,最終導致植物生長受到抑制[2, 47-50]。Wang等[51]研究表明,小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)能夠在高濃度Na+環境下生存,且能夠在體內維持較低的Na+濃度,這主要是依靠其對K+、Na+強大的選擇性吸收能力。隨著NaCl濃度的升高,海濱堿蓬(Suaedamaritima)幼苗體內的K+含量會相應的提高,一方面可以維持植物體內的K+含量,另一方面還可保持相對穩定的K+/Na+,有利于植物生長發育[52]。在鹽脅迫條件下接種枯草芽孢桿菌菌株GB03后擬南芥體內Na+含量與未接種對照相比降低了54%[53];接種菌株GB03還降低了小麥和小花堿茅體內Na+的積累并提高了K+/Na+,從而增強二者的耐鹽性[54-55]。本實驗表明在不同濃度的鹽脅迫處理下,接種WM13- 24與GB03均顯著降低了黑麥草幼苗地上部Na+的積累,同時一定程度增加了地上部K+的含量。并且與GB03相比,WM13- 24更大幅度地降低了根中的Na+水平,在保護黑麥草免受Na+的毒害作用方面效果更加顯著,同時維持了根中更高的K+含量,提高了根中的K+/Na+,從而提高了黑麥草的耐鹽性。

綜上所述,兩株根際促生細菌(WM13- 24和GB03)均維持了多年生黑麥草在鹽脅迫條件下的生長,尤其是分離自梭梭根際的枯草芽孢桿菌WM13- 24效果更佳。接種WM13- 24顯著提高了多年生黑麥草的生物量、葉綠素含量、根系活力、過氧化氫酶活性、可溶性糖、游離脯氨酸含量及地上部鉀/鈉比,降低了丙二醛含量、相對質膜透性、葉片滲透勢,從而提高了多年生黑麥草的耐鹽性。本研究結果為利用荒漠植物根際促生細菌提高草類植物耐鹽性和在鹽堿地區建植牧草和草坪草奠定了一定的理論和實踐基礎。