非小細胞肺癌組織中miR-105、KIFC1的表達變化及其臨床意義

李丹，朱靜，吳君華，徐維國，陳明勇

綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽621000

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，近年來肺癌發(fā)病率及病死率逐漸增高,嚴重威脅人類健康[1]。目前肺癌的治療主要包括手術治療、化療及靶向治療等，但中晚期肺癌患者遠期生存率較低，5年生存率僅約20%[2]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最為常見的類型，約占肺癌所有類型的80%，但由于腫瘤具有較大的異質(zhì)性，不同患者治療的敏感性及預后差異較大[3]。因此，有必要深入研究NSCLC的病因及發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找具有臨床意義的診斷治療靶點。微小RNA(miRNA)是小的內(nèi)源非編碼RNA，近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與細胞增殖、遷移和凋亡過程，與感染、免疫及腫瘤等疾病密切相關[4]。miR-105基因位于Xq28，在胃癌[5]、肝癌[6]等多種腫瘤組織中均存在異常表達的現(xiàn)象，并且miR-105的異常表達參與促進腫瘤的惡性進展，與患者不良遠期生存率有關。驅動蛋白家族成員C1(KIFC1)又稱為HSET，位于6p21.32，在肝細胞肝癌[7]、食管鱗癌[8]中存在表達異常升高的現(xiàn)象，并具有促進腫瘤細胞惡性增殖和遷移的作用，有可能成為腫瘤的診斷治療新靶點。本研究觀察了NSCLC癌組織中miR-105及KIFC1的表達變化，分析兩者與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年6月～2019年12月綿陽市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者120例，男72例、女48例，年齡30～78(56.2±6.5)歲，腺癌75例、鱗癌45例，腫瘤直徑<5 cm者67例、≥5 cm者53例，腫瘤分期Ⅰ期30例、Ⅱ期44例、Ⅲ期37例、Ⅳ期9例，腫瘤分化程度高分化33例、中分化40例、低分化47例，淋巴結轉移49例、無轉移71例。患者均接受手術治療，術中留取綠豆粒大小的癌組織及癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)，液氮速凍后，轉運至標本庫后置于-80 ℃冰箱保存。納入標準：①經(jīng)病理學檢查明確診斷為NSCLC；②首次診治，患者既往均未接受過放化療、免疫治療等治療；③臨床病理資料完整。排除標準：①合并感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病等；②合并其它器官惡性腫瘤；③合并心肝等嚴重器官功能不全。患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書，本研究經(jīng)綿陽市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準通過。

1.2 NSCLC癌組織與癌旁組織中miR-105、KIFC1檢測方法 采用qPCR法。取約100 mg組織標本，TRIzol法提取組織中總RNA，DEPC水稀釋，分光光度計測定總RNA溶液的濃度及純度。以總RNA為模板，按照TaqMan RNA反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄合成cDNA，并進行PCR擴增。引物序列如下：miR-105正向引物為5′-AGGACUCAAAUGCUCAG-3′，反向引物為5′-UCAAAUGCUCAGACUCCUGU-3′；內(nèi)參基因U6正向引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，反向引物為5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′；KIFC1正向引物為5′-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3′，反向引物為5′-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3′，內(nèi)參基因β-actin正向引物為5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向引物為5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。總反應體系20 μL，包括2 μL cDNA，0.1 μL TaqDNA聚合酶、1 μL上下游引物、1 μL 20×SYBR GreenI及0.4 μL濃度為10 mmol/L dNTPs。miR-105 PCR反應條件為：95 ℃、30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃ 退火34 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。KIFC1 PCR反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。所有反應均在ABI7500實時定量PCR儀上完成。以2-ΔΔCt表示組織中miR-105、KIFC1的相對表達量。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 NSCLC癌組織與癌旁組織中miR-105、KIFC1相對表達量比較 NSCLC癌組織組織中miR-105、KIFC1的相對表達量分別為0.52±0.11、2.16±0.25，癌旁組織中miR-105、KIFC1的相對表達量分別為1.13±0.16、1.23±0.15，兩者相比，P均<0.05。

2.2 NSCLC癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量的相關性 NSCLC癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量呈負相關關系(r=-0.602，P<0.05)。

2.3 癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系 癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系見表1。由表1可知，NSCLC癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量與腫瘤分期、組織分化程度有關(P均<0.05)，而與性別、年齡、病理類型、腫瘤大小及淋巴結轉移無關(P均>0.05)。

表1 癌組織中miR-105、KIFC1相對表達量與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

肺癌是最常見的人類惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的主要原因，發(fā)達國家高于發(fā)展中國家[9]。

近幾十年來，我國肺癌的發(fā)病率和病死率有所增加。在病理上，肺癌分為NSCLC和小細胞肺癌，NSCLC占所有肺癌病例的75%～80%。目前手術仍然是NSCLC患者最有效的治療方法，有助于延長患者的生存時間[10]。但是，在早期階段，NSCLC很少表現(xiàn)出明顯的癥狀，很多患者在疾病中晚期被診斷出，手術治療效果不佳。近年來，盡管在化學療法、放射療法和靶向療法等方面均取得了進步，但晚期NSCLC患者的預后仍然很差，嚴重威脅患者生活質(zhì)量及生命健康[11]。

miRNA的表達及功能失調(diào)與腫瘤、自身免疫等多種人類疾病密切相關。miRNA是一類天然的小非編碼RNA，長度為18～22個核苷酸，能夠轉錄后抑制其靶信使RNA的表達。單個miRNA可以通過特異性結合mRNA的3′-UTR區(qū)來調(diào)控數(shù)百種靶mRNA的表達，有望成為預測或早期診斷NSCLC的腫瘤標志物[12]。本研究中，NSCLC癌組織中miR-105的相對表達量為顯著低于癌旁組織，目前其機制尚不清楚，可能與長鏈非編碼RNA如LINC00261能夠直接結合并抑制miR-105靶基因表達有關。研究[13]發(fā)現(xiàn)，肺癌中LINC00261表達升高，通過抑制miR-105，進而抑制下游FHL1基因的表達，促進腫瘤細胞的無限增殖。本研究結果表明，NSCLC癌組織中miR-105的表達與腫瘤分期及組織分化程度有關，表明癌組織中miR-105可能作為一種抑癌基因參與抑制NSCLC的發(fā)生發(fā)展。有研究[14]報道，miR-105能夠直接抑制磷脂酰肌醇3激酶/AKT信號通路的傳導，發(fā)揮抑制腫瘤細胞惡性增殖的作用，而腫瘤發(fā)生時miR-105表達降低，其抑癌能力降低，導致腫瘤的分期分級升高。

驅動蛋白超家族蛋白(KIFs)是一類運動相關蛋白，可以附著在微管上并沿微管移動，以運輸細胞器、蛋白復合物和信使RNA。此外，許多KIF通過參與染色體和紡錘體的運動，在有絲分裂中發(fā)揮重要作用[15]。KIFs家族由45個成員組成，包括39個N-驅動蛋白、3個M-驅動蛋白和3個C-驅動蛋白。KIFC1是KIFs家族中唯一在哺乳動物細胞中具有負端定向運動的成員，它位于6號染色體的短臂上，有4個轉錄本，正向鏈上共有20個外顯子。KIFC1參與許多生理和病理過程，是細胞內(nèi)物質(zhì)的交換并維持細胞存活的驅動力[16]。KIFC1是潛在的癌癥生物標志物和癌癥治療的分子靶標[17]。本研究中，癌組織中KIFC1相對表達量顯著高于癌旁組織，其機制可能是腫瘤細胞中轉錄因子TCF4表達增加，其能夠結合KIFC1基因啟動子區(qū)域并促進KIFC1基因轉錄，導致KIFC1表達升高[17]。此外，本研究中，癌組織中KIFC1表達與腫瘤分期及組織分化程度有關，表明KIFC1表達隨著分期和組織學分級的升高而表達增加，與促進腫瘤發(fā)生發(fā)展有關。我們分析，其機制可能是KIFC1一方面促進Akt磷酸化，進而激活GSK3β信號通路，促進腫瘤細胞的增殖，導致腫瘤分期升高；另一方面，KIFC1促進轉錄因子Snail的表達，促進上皮間質(zhì)轉化等基因的表達，導致腫瘤進展，組織分化程度降低[18]。

本研究中，癌組織中miR-105的相對表達量與KIFC1的相對表達量呈明顯負相關，因而推測兩者可能存在相互調(diào)控的關系。有研究[19]通過雙熒光素酶報告基因實驗證實，KIFC1可作為miR-105的直接靶基因，miR-105結合于KIFC1的mRNA 3′-UTR區(qū)，降低mRNA穩(wěn)定性，降低KIFC1表達，從而抑制腫瘤細胞惡性增殖及遷移等生物學行為。

綜上所述，NSCLC癌組織中miR-105表達降低、KIFC1表達升高，兩者負相關，miR-105、KIFC1表達與腫瘤分期及組織分化程度有關，共同參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有望成為新的NSCLC診斷、治療的腫瘤標志物。