葉酸缺乏的小鼠胚胎干細胞ES-D3中miR-302a、Bcl2L11表達觀察及其靶向關系預測和驗證

梁燕，曹丁丁，李媛媛，劉卓，吳建新

1 山東第一醫科大學附屬省立醫院，濟南250021；2 首都兒科研究所

胚胎發育是一個復雜的過程，受到遺傳與環境的交互調控，但胚胎發育過程中的具體作用機制目前仍未明確。我們前期研究[1～3]發現，葉酸缺乏可導致小鼠胚胎干細胞特異性凋亡增加，引起G0/G1期阻滯，微小RNA302a(miR-302a)可能在其凋亡過程中發揮關鍵作用。無葉酸培養96 h的小鼠胚胎干細胞中Caspase-3表達升高，但凋亡的具體作用機制目前仍未明確。Bcl2L11 (Bcl-2 interacting mediator of cell death) 作為 Bcl-2 家族中僅包含 BH3 的亞家族成員，是一種重要的凋亡調節蛋白[4]。關于Bcl2L11是否參與葉酸缺乏致小鼠胚胎干細胞凋亡過程，是目前的研究熱點。2018年6月～2020年5月，我們觀察了葉酸缺乏的小鼠胚胎干細胞miR-302a及Bcl2L11 的表達變化，對胚胎干細胞凋亡中miR-302a、Bcl2L11的靶向關系進行預測和驗證，旨在為今后研究營養物質在早期胚胎發育中的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 小鼠胚胎干細胞系ES-D3為本實驗室凍存,培養方法同前期研究[1, 2]。DMEM高糖無葉酸培養基購自北京思賽因公司；L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巰基乙醇、丙酮酸鈉、胎牛血清、胰酶替代品、DPBS均購自Invitrogen/Gibco公司；明膠粉末購自Amresco公司；重組小鼠白血病抑制因子(rmLIF)購自Millipore公司；哺乳動物蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀生物有限公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自Promega公司。絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)購自北京干細胞庫；Bcl2L11、β-actin抗體購自Cell Signal Technology公司；引物購自上海捷瑞生物有限公司；雙熒光素酶報告載體購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 葉酸缺乏的ES-D3細胞miR-302a及Bcl2L11檢測

1.2.1 葉酸缺乏細胞培養與分組 取適量ES-D3細胞，置于胚胎干細胞無葉酸培養液中培養，培養液成分如下: 高糖無葉酸DMEM(葡萄糖含量4 500 mg/L)、15%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、非必須氨基酸0.1 mmol/L、2-巰基乙醇0.1 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L、rmLIF 1000 U/L。在0.2%明膠包被培養板，制備MEF單層，小鼠胚胎干細胞置于單層上。37 ℃, 5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。將細胞分為A、B、C、D組，分別于培養0、24、48、72 h時留取細胞，每組3個復孔。

1.2.2 A、B、C、D組細胞miR-302a、Bcl2L11 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取四組細胞，提取總RNA,細胞總RNA提取根據試劑盒步驟，Nanodrop1000分光光度計測總RNA濃度；Promega反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，具體引物序列見表1。反轉錄條件：42 ℃、15 min，95 ℃、5 min, 4 ℃、5 min; 最后按照FastSYBR Mixture試劑盒步驟進行real time PCR反應，體系為25 μL;擴增條件95 ℃、30 s預變性，95 ℃、20 s，95 ℃、3 s，60 ℃、30 s, 40個循環，每份樣品做3個復孔，重復3次。以U6和β-actin作為內參，以2-ΔΔCt代表miR-302a、Bcl2L11 mRNA的相對表達量。

表1 引物列表

1.2.3 A、B、C、D組細胞Bcl2L11(BimEL、BimL及BimS)蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞進行細胞裂解，Bradford法測蛋白濃度。20 μg蛋白樣品以12% SDS-PAGE膠分離后通過濕轉法轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，分別加兔抗Bcl2L11單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗Actin單克隆抗體(1∶5 000)過夜；TBST洗膜3次，10分鐘/次，然后與HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10分鐘/次；增強型ECL化學發光成像，X膠片曝光顯影，并掃描為照片。采用Image J 軟件對蛋白條帶灰度值進行具體量化，以各蛋白與 β-actin蛋白的相對灰度值比值代表目的蛋白的相對表達量。各蛋白重復3次，取平均值。

1.3 miR-302a與Bcl2L11基因靶向關系的預測及驗證

1.3.1 miR-302a與Bcl2L11基因靶向關系的預測 登陸生物信息學軟件TargetScan、PicTar、MiRanda預測miR-302a與Bcl2L11存在靶向結合位點，結果發現miR-302a與Bcl2L11-3′UTR有三個結合位點。

1.3.2 miRNA-302a與Bcl2L11基因靶向關系的驗證 登錄NCBI 數據庫，輸入Gene ID: 10018(gene=“Bcl2L11”)，尋找基因序列信息。根據結合位點設計miR-302a引物，以小鼠3T3 細胞基因組DNA為模板，利用雙熒光素酶報告載體中的XhoⅠ和NotⅠ兩個限制性內切酶，設計3′UTR擴增引物，PCR擴增基因的3′UTR 序列，成功將Bim-3′UTR 795-3006bp片段克隆至pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報告載體中，擴增總長度為2 233 bp。設計Bcl2L11-3′UTR突變引物，將基因中的三處靶序列 TAGCACTT突變成ACGAGTT。突變型載體測序顯示已成功將3處靶序列 TAGCACTT突變成ACGAGTT。所用載體報告熒光為hRluc，校正熒光為hluc(做內參校正),構建Bcl2L11-3′UTR野生載體；設計突變引物將靶標序列突變，構建突變載體。引物序列及靶點測序見表1。

表1 Bcl2L11-3′UTR的引物序列表

miRNA-302a mimics(模擬miRNA-302a表達)及Negative Control(陰性對照，不表達miRNA-302a)分別與Bcl2L113′UTR雙報告基因野生載體及突變載體共轉染，組分別為1組: Bcl2L113′UTR野生型載體+Negative Control；2組: Bcl2L113′UTR野生型載體+miR-302a mimics；3組: Bcl2L113′UTR突變型載體+Negative Control；4組: Bcl2L113′UTR突變型載體+miR-302a mimics。轉染48 h后測定4組報告基因hRluc的相對熒光值。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 A、B、C、D組細胞miR-302a、Bcl2L11 mRNA相對表達量比較 A、B、C、D組細胞miR-302a 相對表達量分別為1.00±0.20、0.65±0.32、0.50±0.22、0.43±0.24，與A 組比較，D 組miR-302a相對表達量下降(P<0.05)。A、B、C、D組細胞Bcl2L11 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.22±0.19、1.82±0.37、3.49±0.45，與A 組比較，D 組Bcl2L11 mRNA相對表達量升高(P<0.05)。

A、B、C、D組細胞BimEL相對表達量分別為0.86±0.02、0.87±0.03、0.92±0.02 、1.10±0.06，與A 組比較，C、D 組BimEL相對表達量升高(P<0.05)。 A、B、C、D組細胞BimL相對表達量分別為0、0.09±0.02、0.16±0.04、0.26±0.03，與A 組比較，B、C、D 組BimL相對表達量升高(P<0.05)。A、B、C、D組細胞BimS相對表達量分別為0、0、0.11±0.04、0.18±0.04，與A 組比較，C、D 組BimS相對表達量升高(P<0.05)。

2.2 miRNA-302a與Bcl2L11基因靶向關系 miR-302a與Bcl2L11存在交互作用。1、2、3、4組hRluc相對熒光值分別為1.00±0.07、0.64±0.02、1.00±0.03、0.95±0.06，與其他組比較，2組hRluc相對熒光值降低(P<0.05)。

3 討論

胚胎發育是一個極其復雜的過程，受遺傳因素和環境因素的交互影響。胚胎生長發育過程是細胞生長、分化、死亡及器官模式形成高度協調的過程，受眾多基因和信號通路在多個水平的精密調控，任一相關基因表達或生物過程異常都可能導致畸形產生[5]。葉酸是一種水溶性B族維生素，人體不能合成，需從食物中攝取。胚胎的發育進程中的主要營養物葉酸相對不足常導致胚胎基因組表達失衡，產生基因組和表觀基因組損傷，進而影響胚胎發育，導致出生缺陷的發生，特別是引起神經管畸形的發生[6, 7]。雖然孕期補充葉酸可顯著降低出生缺陷的發生，但葉酸的作用機理，特別是在胚胎干細胞內的調控機理仍不明確。這也是目前相關領域的研究熱點之一。

本項目前期研究提示,無葉酸培養小鼠胚胎干細胞96 h，大部分胚胎干細胞均已發生凋亡，不利于研究整個凋亡過程，故我們選取無葉酸培養4個時間點(0、24、48及72 h)。葉酸缺乏引起小鼠胚胎干細胞干細胞周期特異性凋亡，多個miRNAs參與其中調控，特別是 miR-302a 在此過程中發揮關鍵作用[1, 8]。miR-302a如何在葉酸缺乏時調控細胞凋亡，其詳盡機制仍不明確。目前已知miR-302家族包含7個成員，屬于miR-302-367簇，各成員之間的種子區序列高度保守(UAAGUGCU)，在小鼠胚胎干細胞、人胚胎干細胞及對應的畸胎瘤細胞和誘導性多能干細胞中特異性表達，通過靶向調節不同的基因，在細胞增殖和凋亡中發揮重要作用[8, 9]。在胚胎發育的早期，miR-92, miR-19, and miR-20 家族成員可靶向調控凋亡前蛋白Bim表達，調控細胞增殖與凋亡[10]。在腫瘤細胞中，miR-92、miR-195及miR-326均可靶向調控Bim表達，影響細胞凋亡[11～13]。本課題組前期研究[2]發現葉酸缺乏時，Caspase-3 在mRNA和蛋白水平表達均上調，表明葉酸缺乏通過Caspase-3途徑促進細胞凋亡。Caspase-3作為細胞凋亡的中心環節及執行者，位于整個信號通路的下游。而Bcl-2蛋白家族作為Caspapse上游調節蛋白，可分為兩類：抗凋亡蛋白，比如Bcl-2、MCL-1和Bcl-XL；促凋亡蛋白，比如BAX、BAK和BIM。這兩類蛋白之間關系錯綜復雜，通過各種蛋白結合可以維持細胞凋亡狀態的平衡。Bim/Bod是一種促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族中僅包含BH3的亞家族，該亞家族成員包括 Bad、Bid、Bik、Hrk 和 Noxa，都包含一個 BH3 結構域，但缺乏其他保守的 BH1 或 BH2 結構域[13～15]。本實驗結果顯示隨著葉酸缺乏時間延長，miR-302a表達逐步下調，而Bcl2L11 mRNA及蛋白相對表達量均明顯升高，進一步通過生物信息學預測及雙熒光報告實驗證實兩者之間存在靶向調控關系，由此我們推測miR-302a可通過調控Bcl2L11表達，促進細胞凋亡程序啟動。

Bcl2L11可通過結合并拮抗 Bcl-2 家族的抗凋亡成員,誘導細胞凋亡[16]。Bcl2L11(Bim)表達時，通過選擇性剪切會產生三種主要的 Bim 同工型：BimEL、BimL 和 BimS。BimS是最短的同工型，細胞毒性最強，通常僅在細胞凋亡過程中瞬時表達。BimEL 和 BimL 同工型能通過與動力蛋白輕鏈相互作用被隔絕到動力蛋白運動復合體，并在細胞凋亡期間從這個復合體上釋放[14, 17]。Bim 轉錄水平調控受到多種信號途徑的調節,其中轉錄因子 FoxO1 通過 PI3K/AKT 信號通路能夠聚集細胞內外的多重下游信號分子，調節細胞內外應激信號之間的平衡，參與調控Bim表達，FoxO的磷酸化與非磷酸化狀態與轉錄調節功能密切關系[15,18～20]。后續實驗將進一步尋找Bim相關的上游信號通路，構建轉錄因子-miRNAs-基因共調控網絡[21,22]，獲得轉錄因子-miRNA參與調控葉酸缺乏影響胚胎發育過程的實驗依據。

綜上所述，隨葉酸缺乏時間延長，ES-D3細胞miR-302a相對表達量降低，Bcl2L11 mRNA及蛋白相對表達量升高。miR-302a可能通過靶向調節Bcl2L11基因表達，在葉酸缺乏引起的ES-D3細胞周期特異性凋亡過程中發揮重要作用，但其中具體信號通路仍需進一步深入探究。