ERIC-PCR技術與MLST技術對30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因分型結果觀察

王方，吳新明，王彥，梁偉

連云港市第二人民醫院，江蘇連云港222000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)是一種常見的臨床致病菌，可導致院內感染和社區獲得性感染，老年人、手術患者及長期使用抗生素的患者為肺炎克雷伯桿菌的易感人群[1]。碳青霉烯類抗菌藥具有穩定性好、抗菌譜廣等優點，是臨床治療肺炎克雷伯菌感染的最有效藥物，也是最后一道防線[2, 3]。隨著抗生素藥物廣泛使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一種多重耐藥病菌株不斷涌現，導致臨床上治療肺炎克雷伯菌感染患者的無效率超過了半數[4]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌給臨床抗感染治療帶來了巨大挑戰。對肺炎克雷伯菌進行同源性分析是研究其感染狀況、耐藥機制以及流行病學研究的重要工具。因此建立快速準確的同源性分析方法極為重要。腸桿菌基因間重復一致序列PCR(ERIC-PCR)是根據ERIC的核心序列設計引物，PCR擴增兩個ERIC之間序列，不同細菌的ERIC序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據擴增條帶位置和數量來判斷是否為同一基因型多位點序列分型。多位點序列分型(MLST)是一種基于管家基因核酸序列測定的細菌分型方法，既適于分子流行病學調查, 也可用于細菌的分子進化研究。目前關于ERIC-PCR、MLST在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌基因分型方面的研究較少。因此，我們分別采用ERIC-PCR和MLST法對30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行基因分型，并比較兩種方法的基因分型結果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、試劑及儀器 選擇2017年1月～2018年12月間連云港市第二人民醫院分離的30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株標本，主要來源于重癥監護室、腦血管外科和呼吸內科等；標本類型分為痰及支氣管分泌物(53.3%)、尿液(23.3%)、血液(13.3%)、切口分泌物(10%)。30株菌株中沒有同一患者的重復分離株。PCR儀(Applied Biosystems，美國)；電泳儀和凝膠成像儀(北京六一公司)；VITEK-2全自動細菌分析儀(法國生物梅里埃生物有限公司)；DNA Marker 購自天跟生化有限公司；PCR Mix購自LABLEAD；相關擴增引物和測序由杭州有康生物技術有限公司合成。

1.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥情況觀察 采用藥敏試驗。采用VITEK-2細菌分析儀觀察30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株對阿米卡星、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢唑林、環丙沙星、頭孢曲松(菌必治)、頭孢替坦、頭孢吡肟、慶大霉素、亞胺培南(泰能)、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、復方新諾明、妥布霉素等16種抗菌藥物的耐藥性，結果根據美國臨床實驗室標準化研究所2015版標準進行判斷。

1.3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因分型

1.3.1 制備菌株基因組模板 采用煮沸法提取30株菌株的基因組DNA。首先挑取分純后的2～3個單菌落于含有200 μL無菌水的EP管中混勻，100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，所得上清即可作為后續PCR反應的模板。

1.3.2 碳青霉烯酶基因的擴增 利用PCR技術擴增30株菌株基因組DNA中的碳青霉烯酶基因，包括KPC-2、NDM-1、IMP、VIM、OXA，引物序列參照相關文獻設計[5](表1)，由杭州有康生物公司合成。擴增體系為25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各加入1 μL、DNA模板2 μL、加無菌超純水至25 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 min，循環30次，最后72 ℃延伸10 min。對擴增結果陽性產物進行測序(杭州有康生物公司)，所得序列在NCBI網站上進行Blast比對分析。從而確定碳青霉烯酶耐藥基因的分型。

表1 碳青霉烯酶基因的擴增引物序列

1.3.3 基因分型方法

1.3.1 MLST分型方法 肺炎克雷伯菌的7個管家基因序列、引物序列及分型都參照巴斯德研究院的推薦，網址https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html，7個管家基因分別為gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB。PCR反應體系為30 μL，包含15 μL 2×PCR Mix、上引和下引各1.5 μL，2 μL模板 DNA和10 μL無菌超純水。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 min，循環30次，最后72 ℃延伸10 min。擴增片段測序后與數據庫數據比對得出等位基因譜，從而得到相應的序列型。

1.3.2 ERIC-PCR分型方法 根據腸細菌基因間共有重復序列ERIC設計引物ERIC-F(5’-ATGT AAGCTCCTGGGGATTCAC-3’)、ERIC-R(5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)。PCR反應體系為20 μL，包含10 μL 2×PCR Mix、ERIC-F和ERIC-R各1 μL，2 μL模板 DNA和6 μL無菌超純水。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，44 ℃退火1 min，65 ℃延伸4 min，循環30次，最后65 ℃延伸16 min。運用NTSYS軟件對ERIC-PCR電泳圖進行聚類分析，聚類樹狀圖相似系數(SI)>90%，且無明顯條帶差異定為同一基因型。

2 結果

2.1 30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對16種抗菌藥物的敏感率、中介率及耐藥率比較 30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢吡肟、亞胺培南(泰能)、和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均為100%，阿米卡星和復方新諾明的耐藥率為76.6%，其他藥物的耐藥性介于兩者之間。結果見表2。

表 2 30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對16種抗菌藥物的敏感率、中介率及耐藥率比較

2.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因擴增結果 30株菌株中，25株菌KPC-2基因擴增陽性，2株NDM基因擴增陽性，1株KPC-2、NDM-1基因擴增陽性，2株未檢測到碳青霉烯酶基因。

2.3 ERIC-PCR分型結果 ERIC-PCR指紋圖譜結果擴增條帶清晰，數目為5～12條，產物最長的超過2 000 bp，最短的小于100 bp。根據聚類樹狀圖結果可將30株菌株分為5個譜型，分別為以A型(83.3%，25/30)，B型(6.6%，2/30)、C型(3.3%，1/30)、D型(3.3%，1/30)和E型(3.3%，1/30)。

2.4 MLST分型結果 30株菌分為5種ST序列型，分別ST11(83.3%)、ST76(3.3%)、ST392(3.3%)、ST641(6.6%)和ST1322(3.3%)。在30株菌中ST11型占絕對優勢，分布較集中，克隆株相對單一。

2.5 ERIC-PCR與MLST分型結果的比較 30株菌當中的1、2、3、4、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27號在ERIC-PCR分型系統中屬于A型，在MLST分型結果當中屬于ST11；29、30號菌在兩種分型方法當中分別屬于B型和ST64；5號菌分別屬于C型和ST1322；11號菌分別屬于D型和ST392；28號菌分別屬于D型和ST64。兩種方法對于30株菌的分辨率完全相同。

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫院內重要的條件致病菌之一，可引起呼吸系統、血液系統、泌尿系統及消化系統等感染[6]。近年來由于抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌數量逐年增加[7, 8]。在本研究中30株肺炎克雷伯菌的藥物敏感性結果顯示，包括亞胺培南在內的16種抗菌藥物耐藥率均大于70%，其中對頭孢他啶、頭孢唑林、氨芐西林、氨曲南、氨芐西林/舒巴坦、亞胺培南、頭孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率可達100%，說明其耐藥性非常嚴重。而我院存在肺炎克雷伯菌感染的患者病死率達到了48.7%，高致死率可能與患者具有基礎性疾病或并發癥相關。因此，快速準確地進行臨床分離菌株的同源性分析，避免院內感染在更大范圍內暴發具有的意義。

判斷醫院內是否發生感染的一種重要的方法就是比較同一時期分離菌株之間的同源性。目前，常用的同源性分析方法有很多，主要包括核糖體分型(Ribotyping)、隨機擴增PCR(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、MLST、脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophore，PFGE)和ERIC-PCR等[9, 10]。其中MLST技術是通過擴增細菌基因組中的7個管家基因片段，將獲得的序列數據與數據庫進行比對，每個管家基因序列都將獲得一個唯一的等位基因號，7個等位基因號組合成為唯一的MLST型別[11]。MLST實驗結果已經能夠標準化和數字化，因此該技術具有較高的分辨率和重復性。是目前國際上公認的最為客觀的同源性分析方法[12]。

ERIC-PCR 技術是在90年代開始由sharples和HuIton等建立的一種用于細菌同源性分析的一種技術[13]。該方法根據腸細菌基因間一段高度保守的共有重復序列設計引物，根據擴增所獲得的電泳圖結果來判斷不同菌株之間的同源性[14, 15]。腸桿菌科基因間重復序列(ERIC)是一段長度為126 bp序列，位于染色體的非編碼區，核心區域有一段具有高度保守性的反向重復序列。根據ERIC的核心序列設計引物，采用PCR的方法擴增兩個ERIC之間的序列。不同細菌的ERIC 序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據擴增條帶位置和數量來判斷是否為同一基因型[16, 17]。該方法具有操作簡單、成本低和周期短等優點，適用于大批量樣本的流行病學調查[18]。Qing等[19]利用 MLST和ERIC-PCR兩種方法對700株大腸桿菌進行了同源性的分析，得出兩種方法具有相同的分辨率。蘇珊珊等[20]對從重癥監護室分離出了16株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行基因分型，ERIC-PCR檢測為同一型別，MLST結果顯示均為ST76型，這表明兩種分型方法得出的結果一致。

本研究對分離的30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行ERIC-PCR和MLST基因分型，結果顯示ERIC-PCR可以將30株菌分為5個基因型，分別為A～E型，其中以A型為主，占總數的83.3%，其它四種類型共占16.7%。MLST結果表明，30株菌仍可以分為5個基因型，分別為ST11、 ST641、 ST76、ST392和ST1322，其中ST11占83.3%，其它四種類型共占16.7%。本研究中的30株耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌ST分型具有明顯的集中分布特點，其中ST11 型占據絕對優勢。據報道[21]，ST11 型克隆株主要在中國、韓國、新加坡等亞洲國家流行。而在美國和歐洲等國家耐藥的肺炎克雷伯菌主要的流行株為ST258 型[22]。ST11型與ST258型菌株具有很高的同源性，兩者僅有tonB這個管家基因序列不同，其余 6 個管家基因序列完全一致。據報道ST258型菌基因組中含有一段特殊的區域，該區域與莢膜多糖的合成有關，可以幫助細菌逃避宿主免疫系統的攻擊，從而使其更易傳播[23,24]。但是目前關于ST11和ST258如何成為優勢克隆株的確切機制仍然不清晰，有待進一步研究。

PCR 擴增結果顯示共檢測到2種碳青霉烯酶基因，分別為 KPC-2和NDM-1。其中，KPC-2型碳青霉烯酶基因共檢出26株，占總數的86.7%，NDM-1型共檢出3株，占總數的10%。在中國，blaKPC-2和blaNDM-1基因是腸桿菌科細菌中最主要的耐藥性碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2是肺炎克雷伯菌中最常見的碳青霉烯酶基因[25]。自從 blaKPC-2基因發現以來，各國均有產KPC型耐藥性的肺炎克雷伯菌流行的報道，我國多地也報道[26]了產 KPC-2 型肺炎克雷伯菌，并已成為我國肺炎克雷伯菌耐藥的最主要原因。

本實驗對ERIC -PCR和MIST兩種分型方法進行比較，ERIC-PCR得到的5個譜型分別對應MLST的5種ST序列型，因此，可以得出兩種分型方法在肺炎克雷伯菌的基因分型中結果一致，表明兩者的分辨率相同。30株菌均具有相同的ERIC-PCR型和ST型，說明這兩種方法在肺炎克雷伯菌基因分型的分辨率相同。MLST是基于對多個管家基因序列分析的分子分型技術，菌株同源性分析結果更加保守，適用于長時間跨度、大范圍的分子流行病學研究。但MLST實驗過程中需要對管家基因序列進行測序，價格昂貴，而且工作量大，要推廣到每個實驗室有一定的難度[27]。而ERIC-PCR具有靈敏度高、分辨率高、穩定性高、重復性好、的特點，又有操作簡單、成本低、檢測快捷、無需特殊儀器的優勢，易于在臨床上推廣，近年來被廣泛應用于細菌鑒定及基因分型研究。

綜上所述，30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株均為多重耐藥菌。ERIC-PCR與MLST分型用于肺炎克雷伯菌基因分型中分辨率相同，ERIC-PCR具有靈敏度高、分辨率高、穩定性高、重復性好、的特點，又有操作簡單、成本低、檢測快捷、無需特殊儀器等優點，易于在臨床上推廣，可用于耐碳青霉烯類肺炎克雷伯軍細菌的鑒定及基因分型研究。