四肢骨折延遲愈合患者血清miR-206、IGF-1、sICAM-1水平變化及診斷效能

周偉，黃松，魏優秀

華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院,武漢 430000

骨折延遲愈合指骨折患者患處在正常愈合期(一般為4個月內)仍未達到骨折完全愈合的標準，骨折部位仍然有疼痛、壓痛及異常活動，影像檢查顯示骨折線沒有模糊，骨痂生長稀少。骨折延遲愈合是骨折患者治療后的常見并發癥，可明顯延長患者病程，增加二次手術機會[1]。研究發現，年齡、營養、免疫、骨折類型、斷端情況、血供、感染、骨質疏松、骨折情況等因素均可影響骨折處愈合。分子生物學認為，骨細胞的正常分化、增殖對骨折處的愈合起決定性作用，其中多種細胞因子、炎性因子、黏附分子等均參與了骨細胞的形成過程[2]。微小RNA-206(micro RNA-206，miR-206)是特異性表達于骨骼肌細胞miRNA家族成員，可調控骨骼肌細胞的生長、增殖、凋亡[3]。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor -1，IGF-1)是一種骨生成刺激因子，具有促使骨愈合和成骨細胞生成作用[4]。可溶性細胞間黏附分子(soluble intercellular cell adhesion molecule，sICAM-1)是細胞間、細胞和外基質間黏附分子，能促使白細胞黏附趨化，在骨折延遲愈合患者中呈高表達，經治療后可出現下降[5]。目前，miR-206、IGF-1、sICAM-1在骨折延遲愈合中的作用機制尚不清楚。2017年5月～2019年10月，我們觀察了四肢骨折患者血清miR-206表達及IGF-1、sICAM-1水平變化，分析骨折延遲愈合的影響因素，探討其對骨折延遲愈合的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期我院骨科收治的骨折患者159例，納入標準：①首次發生骨折患者；②骨折部位為四肢；③均為單側骨折。排除標準：①骨代謝疾病、合并骨腫瘤者；②合并嚴重肝腎功能障礙者；③多發骨折或合并顱腦損傷者；④出院后失聯未定期復查患者。本研究以書面形式向我院倫理委員會提出臨床試驗申請并獲得批準，均獲得患者及其家屬同意，并簽署同意書存檔。

1.2 四肢骨折患者血清miR-206、IGF-1及sICAM-1、檢測 分別于術前(T0)及術后第3天(T1)、第1周(T2)、第4周(T3)采集清晨靜脈血5 mL。①miR-206檢測 采用實時熒光PCR法。取不同時間的患者血清，TRIzol法提取總RNA，選擇吸光度值A260 /A280 RNA樣品，采用M-MLV 逆轉錄酶(Epicentre 公司)按照試劑盒說明將其轉錄為cDNA。CFX96實時熒光PCR 儀(美國Bio-Rad)檢測血清中miR-206表達，引物合成及序列測定由上海基康公司完成，序列如下：miR-206上游引物：5′- ACGGTCCTCCTGGTCTTT-3′，下游引物5′- TGGCTGGCTGCATTGC-3′。以U6為內參，U6上游引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95 ℃變性10 s， 65 ℃退火20 s; 75 ℃延伸15 s，共40個循環。以U6為內參。以2-ΔΔCt代表miR-206的相對表達量。重復3次，取平均值。②血清IGF-1、sICAM-1檢測 采用ELISA法。分別于術前(T0)、術后第3天(T1)、術后第1周(T2)、術后第4周(T3)采集，離心(4 ℃ ，3 000 r/min，離心時間15 min，離心半徑10 cm)后取血清,-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)保存待檢。取出樣品快速解凍血清樣品，ALISEI全自動酶標儀(意大利SEAC公司)采用ELISA法檢測血清IGF-1、sICAM-1，試劑盒購自武漢博士德公司，所有操作均按試劑盒說明書進行。

1.3 資料收集方法 159患者均行手術(鋼板內固定、髓內釘固定)固定骨折處，記錄患者年齡、性別、骨折類型、損傷機制、合并疾病、骨質疏松、手術方式、術后負重時間等資料。術后3個月觀察159例患者骨折愈合情況。骨折延遲愈合定義為骨折后≥3個月X 線示無或極少骨痂生成，斷端骨質可見硬化、間隙[6]。術后3個月時，159例患者根據是否存在骨折延遲愈合分為骨折延遲愈合(延遲組)89例、骨折部位正常愈合(正常組)70例。骨質疏松按照2017版《原發性骨質疏松癥診療指南》[7]，將術后開始負重時間超過12周定義為術后負重延遲[8]。

2 結果

2.1 不同時間點兩組血清miR-206相對表達量及IGF-1、 sICAM-1水平比較 兩組血清miR-206相對表達量及IGF-1、 sICAM-1水平比較見表1。

表1 不同時間點兩組血清miR-206相對表達量及IGF-1、 sICAM-1水平比較

2.2 四肢骨折延遲愈合的影響因素 延遲組≥60歲比例、開放性骨折比例、骨質疏松比例、延遲負重比例高于正常組(P均<0.05)，兩組性別、損傷機制、多發傷、合并基礎疾病、手術方式比較無統計學差異(P均>0.05)。

延遲組患者中年齡≥60歲50例、<60歲39例，男53例、女36例，正常組分別為24、46、46、24例。延遲組損傷類型為開放性骨折49例、閉合性骨折者40例，損傷機制為交通事故傷23例、高空墜落傷19例、跌倒31例、運動傷16例；正常組分別為21、49、20、17、27、6例。延遲組存在多發傷26例，合并基礎疾病為高血壓21例、糖尿病26例、冠心病24例，存在骨質疏松56例；正常組分別為21、19、18、21及26例。延遲組手術方式Wie鋼板內固定術49例、髓內釘固定術40例，存在延遲負重37例；正常組分別為43、27及57例。

骨質疏松、開放性損傷類型、T3基線血清miR-206、IGF-1、sICAM-1是骨折延遲愈合的危險因素(P均<0.01)，見表2。

表2 骨折延遲愈合的影響因素Logistic回歸分析結果

2.4 血清miR-206、IGF-1、 sICAM-1水平及三者聯合對骨折延遲愈合的診斷效能 T3基線時，當血清miR-206、IGF-1、sICAM-1診斷骨折延遲愈合的截斷值分別為0.62、291.34 μg/L、202.43 ng/mL時，其診斷骨折延遲愈合的靈敏度分別為72.41%、79.31%、70.11%，特異度分別為72.86%、80.00%、84.29%，陽性預測值為76.83%、86.13%、77.22%，陰性預測值分別為68.00%、75.68%、66.67%，AUC分別為0.690(95%CI：0.606～0.773)、0.682(95%CI：0.596～0.767)、0.709(95%CI：0.626～0.793)。血清miR-206、IGF-1及sICAM-1聯合診斷骨折延遲愈合的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為91.95%、91.43%、93.02%、90.14%，AUC為0.895(95%CI：0.837～0.95)。T3時刻血清miR-206、IGF-1及sICAM-1聯合應用時AUC高于各指標單獨應用時的AUC(z=3.021、3.162、2.615，P<0.05)。

3 討論

骨折愈合機制復雜，主要包括血腫形成、原始骨痂形成、骨痂改建過程，骨細胞、間充質細胞能否正常增殖分化是骨折愈合決定性因素之一，但是除骨組織自身外，多種細胞和分子相互作用參與骨折愈合過程[2]。骨科醫師應從細胞、分子水平了解骨折愈合機制，探討骨折延遲愈合的原因，以早期發現骨折延遲愈合信息，更有效的采取針對性措施促使骨折正常愈合。

miR-206屬于miR-1家族成員之一，在骨骼肌、成骨細胞中均有表達，參與骨細胞增殖、分化、凋亡調控，與骨骼系統疾病、惡性腫瘤形成均有關[9]。miR-206在骨折延遲愈合中的作用機制報道十分少見。本研究發現miR-206在延遲組表達較高，尤其是術后第1周、術后第4周，且術后第4周miR-206高表達與骨折延遲愈合相關，是導致骨折延遲愈合的危險因素之一。體外研究[10]顯示,miR-206過表達通過抑制程序性細胞死亡4 (programmed cell death 4，PDCD4)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和B細胞淋巴瘤2 (B cell lymphoma 2，Bcl-2)表達，增加凋亡調節因子Bcl2-X相關蛋白(Bcl2 X associated protein，Bax)表達，降低骨細胞活力和增殖能力，誘導細胞凋亡。也有報道[11]顯示,miR-206通過與其靶基因Cx43基因結合，抑制Cx43表達和功能，影響骨組織細胞間信號通路，降低成骨分化能力。提示miR-206可抑制成骨細胞分化，在骨折愈合過程中可能發揮抑制成骨細胞分化，骨形成作用。

IGF-1是一種分泌型小肽生長因子，具有調節生長激素、中間代謝、組織修復作用[12]。生長激素通過核因子κB受體激活劑、配體刺激骨保護素的產生以及在骨基質中蓄積，在維持骨代謝穩定方面發揮重要作用[13]。IGF-1作為調控生長激素的關鍵因子參與成骨細胞形成過程，在骨骼生長和骨折修復中起到重要的作用。本研究發現延遲組血清IGF-1水平低于正常組，說明IGF-1缺乏可能與骨折愈合有關，經回歸分析證實低IGF-1水平是骨折延遲愈合的危險因素，提示骨折延遲愈合患者可能存在IGF-1 生成不足，導致骨細胞和軟骨細胞增殖活性降低，骨形成障礙。IGF-1通過復雜的激素相互作用調控生長激素水平，增強成骨細胞活性，促使骨骼細胞有絲分裂和Ⅰ型膠原合成，并通過抑制膠原酶表達來減少骨膠原降解，刺激線性骨生長，激活骺軟骨前細胞，達到促使骨細胞形成、骨愈合目的[14]。IGF-1缺失導致骨合成代謝障礙，導致骨吸收增加，骨量減少，給予IGF-1 可通過PI3K/AKT信號通路上調環氧化酶-2表達，逆轉成骨抑制[15]。

sICAM-1是一類位于細胞表面介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質黏附相互作用的糖蛋白，表達于內皮細胞、單核細胞和淋巴細胞等，在組織損傷修復、免疫應答、炎癥反應中起到重要的作用[16]。現有研究顯示骨折延遲愈合患者中血清sICAM-1水平處于較高水平[17]，sICAM-1與骨不連的發生呈正相關[18]。本研究結果證實sICAM-1水平升高與骨折后延遲愈合有關，術后4周高水平sICAM-1是骨折延遲愈合的危險因素。ICAM-1參與骨折愈合機制為：骨組織結構損傷過程包含壞死、炎癥反應、骨折修復等，涉及細胞外基質變化，骨折后sICAM-1表達升高介導細胞間、細胞與細胞外基質粘附，誘導中性粒細胞聚集，導致骨折端過度炎癥反應，進而抑制成骨細胞增殖，誘導成骨細胞凋亡和軟骨細胞損傷，導致骨折延遲愈合[19]。

本研究術后4周miR-206、IGF-1、sICAM-1水平與骨折延遲愈合關系最為密切，提示術后4周檢測血清miR-206、IGF-1、sICAM-1水平有助于早期預測骨折愈合情況， ROC分析結果也證實術后4周miR-206、IGF-1、sICAM-1在骨折愈合診斷中均有一定應用價值，聯合三項指標能提高預測準確性。本研究尚未檢測4周后血清miR-206、IGF-1、sICAM-1水平，考慮臨床影像學復查多在術后4、8、12周進行，隨著檢測時間延長可能導致過度診斷的可能，且不利于早期發現骨折愈合異常。本研究兩組患者血清miR-206表達及IGF-1、sICAM-1水平在術前、術后第3天、術后1周已經出現差異，提示在骨折損傷早期延遲愈合患者體內miR-206、IGF-1、sICAM-1水平已經出現明顯改變，因此應早期加強血清學檢測，以發現高風險患者，采取針對性采取措施，促使骨折愈合。Logistic回歸分析結果顯示骨質疏松、損傷類型也與骨折延遲愈合有關，骨質疏松患者多伴骨代謝異常，骨形成緩慢，骨量減少，伴骨質疏松患者骨折部愈合緩慢，甚至可能出現不愈合[20]。不同骨折類型影響骨折愈合進程，開放性骨折多伴軟組織損傷，影響骨折端血供和營養供給，可延遲骨折愈合進程。

綜上所述，骨折延遲愈合患者血清miR-206表達、sICAM-1水平升高，IGF-1水平降低，術后4周血清高miR-206表達、sICAM-1水平及低IGF-1水平可能與骨折愈合發生密切相關，血清miR-206表達、sICAM-1及IGF-1水平診斷骨折延遲愈合的靈敏度、特異度均較高，可作為生物學標志物用于骨折延遲愈合的診斷。臨床應結合骨折愈合危險因素，對延遲愈合患者進行合理準確的評估，以最大程度降低骨折延遲愈合發生率。