米非司酮對人上皮性卵巢癌耐藥細胞系SKOV3/DDP的增殖抑制、耐藥性逆轉作用觀察

高寶榮,劉虹

1四川大學華西第二醫院，成都 610041；2 天津市中心婦產醫院

卵巢癌是女性三大常見的生殖器惡性腫瘤之一，以鉑類為基礎的聯合化療是目前臨床治療卵巢癌的主要方法。但卵巢癌細胞然而臨床實踐中發現化療藥物耐藥是卵巢癌治療效果不佳的主要原因[1]。降低或逆轉卵巢癌癌細胞對化療藥物的耐藥性一直是該領域的研究熱點。米非司酮(mifepristone, MIF)是一種孕激素拮抗劑，目前臨床將其用于胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和白血病等疾病的治療中，具有抗腫瘤、逆轉腫瘤細胞的耐藥性等作用[2]。關于MIF在逆轉卵巢癌細胞耐藥方面的研究較少。2019年1月起，我們測算了MIF對人上皮性卵巢癌耐藥細胞系SKOV3/DDP細胞的非細胞毒性劑量，以此為逆轉劑量，觀察加入逆轉劑量MIF的SKOV3/DDP對順鉑(DDP)耐藥情況，并初步探討其可能作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3、SKOV3順鉑(DDP)耐藥細胞系SKOV3/DDP購自中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所。MIF購自北京紫竹藥業有限公司，DDP購自山東齊魯制藥公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 SKOV3、SKOV3/DDP細胞培養 SKOV3、SKOV3/DDP細胞培養于含10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養液中，37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，SKOV3細胞傳代時間2～3 d，SKOV3/DDP細胞傳代時間5～7 d。SKOV3、SKOV3/DDP細胞傳2～3代后消化備用。

1.3 MIF對SKOV3/DDP的增殖抑制作用觀察及逆轉劑量選擇 采用MTT法。取對數生長期的SKOV3、SKOV3/DDP細胞，調整細胞懸液濃度為6×104/mL，將該濃度細胞懸液接種于96孔板，每孔加入100 μL，培養24 h。SKOV3、SKOV3/DDP細胞分別分為實驗組、空白組及對照組，實驗組分別加入0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L的MIF，每個濃度3個復孔，對照組正常培養，空白組只加入培養液。培養48 h時，每孔加入20 μL MTT溶液,繼續孵育4 h。采用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值,測算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。重復3次，取平均值。根據所測得OD值結果發現，0.625～40 μmol/L的MIF均可抑制SKOV3、SKOV3/DDP的細胞增殖，MIF濃度與細胞增殖抑制率的相關系數分別為0.779、0.881，呈線性相關，隨著MIF濃度的增加，細胞的抑制率增加。繪制量-效曲線，選取SKOV3、SKOV3/DDP增殖抑制率均<5%的MIF濃度，并將此作為逆轉劑量。

1.4 DDP對SKOV3/DDP細胞的半數抑制濃度及細胞耐藥指數測算 采用MTT法,細胞培養及實驗方法均同“1.3”。取適量SKOV3、SKOV3/DDP細胞，分別分為實驗組、空白組及對照組，實驗組分別加入100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 μg/mL的DDP,對照組正常培養，空白組只加入培養液。培養72 h時，加入20 μL MTT溶液,繼續孵育4 h。采用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值,測算細胞增殖抑制率，進一步計算兩種細胞對DDP的半數抑制濃度(IC50)，計算SKOV3/DDP細胞耐藥指數(RI)。RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。重復3次，取平均值。

1.5 逆轉劑量的MIF對SKOV3/DDP的耐藥性逆轉作用、細胞周期影響觀察

1.5.1 逆轉劑量的MIF對SKOV3/DDP的耐藥性逆轉作用觀察 MTT法測算MIF對SKOV3/DDP細胞的耐藥逆轉倍數。取適量SKOV3/DDP細胞，分為A、B兩組，A組加入RI劑量DDP,B組加入4.61 μg/mL的DDP+逆轉濃度(5 μmol/L)的MIF ,細胞培養及實驗方法均同“1.3”，分別于培養24、48、72 h時測算細胞IC50，計算MIF對SKOV3/DDP細胞的耐藥逆轉倍數(reversal fold, RF)。RF=IC50(DDP)/IC50(DDP+MIF)。

1.6 逆轉劑量的MIF對SKOV3/DDP的細胞周期影響觀察 取對數生長期SKOV3/DDP細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，接種于6孔板，加入5 μmol/L的MIF ，分別于培養24、48、72 h時收集細胞，預冷PBS洗滌細胞2次，加入預冷70%乙醇固定細胞，并吹打成細胞懸液，4 ℃固定過夜。2 000 r/min離心10 h，用PBS再洗滌細胞1次，加入500 μL的PBS[含50 μg/mL碘化丙啶(PI)，100 μg/mL Rnase A，0.2%Triton X-100]，4 ℃避光孵育30 min。用50 μm尼龍網過濾樣品后上機檢測，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析細胞周期。

2 結果

2.1 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖抑制率比較及MIF逆轉劑量 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖抑制率比較見表1。進一步得到，MIF對SKOV3/DDP的逆轉劑量為5 μmol/L。

表1 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖抑制率比較

2.2 DDP對SKOV3/DDP細胞的IC50及RI DDP對SKOV3、SKOV3/DDP的IC50分別為3.22、14.83 μg/mL，SKOV3/DDP細胞對DDP的RI為4.61。

2.3 MIF對SKOV3/DDP細胞耐藥性的逆轉作用 培養24、48、72 h時A組IC50分別為(23.13±0.83)、(14.83±0.52)、(10.07±0.56)μg/mL；B組分別為與(17.06±0.53)、(7.77±0.47)、(4.06±0.69)μg/mL，MIF對SKOV3/DDP細胞耐藥性的RF分別為1.36、1.91、2.48倍。2.4 加入MIF的SKOV3/DDP細胞周期比較 培養24、48、72 h時，加入MIF的SKOV3/DDP細胞G0/G1期所占比例分別為48.7%、53.9%、55.1%、59.0%，S期所占比例分別為13.5%、9.6%、7.7%、5.8%，G2/M期所占比例分別為37.8%、36.5%、37.2%、35.2%。

3 討論

卵巢腫瘤的病死率居婦科惡性腫瘤首位，手術聯合化療使晚期卵巢癌患者的近期生存率有了明顯提高，但治療后患者5年生存率仍為25%～30%。多數卵巢癌患者在治療初始階段對化療較敏感，但是隨著療程的延續逐漸出現獲得性耐藥，如何逆轉卵巢癌耐藥對提高卵巢癌患者生存率至關重要。傳統改善耐藥性主要有兩種方法：一是尋找對耐藥細胞更為有效的抗腫瘤藥物；另一種是通過增加細胞內的藥物濃度逆轉耐藥性。

MIF作為一種孕激素和糖皮質激素受體拮抗劑，臨床上主要作為一種計劃生育類用藥。近年來研究發現MIF還具有一定程度的抗腫瘤作用，可能與其誘導細胞凋亡、改變細胞周期等有關。Cui等[3]觀察到在乳腺癌細胞MCF-7中，MIF能夠阻斷孕激素對凋亡抑制基因胰島素樣受體-2的上調，從而抑制癌細胞的生長。MIF還能夠顯著抑制體內移植瘤的生長，且在激素受體陰性的腫瘤中也具有相同的抑制作用[4～6]。不僅如此，在耐藥的腫瘤細胞中，MIF也同樣能夠抑制腫瘤細胞生長的作用。Gamarra-Luques等[7]發現，卵巢癌細胞系IGROV-1及 SKOV-3經順鉑-紫杉醇耐藥處理前后，它們對MIF均顯示出相似的敏感性，這種敏感性以劑量相關的方式阻礙了它們的生長。本研究中也得到了類似的結論，我們所采用的SKOV3、SKOV3/DDP細胞系均為孕激素受體表達陰性的細胞系，且SKOV3/DDP為順鉑耐藥細胞，經MIF作用后，兩種細胞的生長均受到不同程度的抑制，呈劑量依賴性。

既往研究及本研究結果，均可看出MIF不同于強效的化療藥物，其對腫瘤細胞的抑制程度較低。因此，在基礎和臨床研究中，常將MIF作為一種增敏劑與細胞毒性藥物或激素類藥物聯合，起到協同或增敏的效果[8]。Jurado等[9]在宮頸癌Hela細胞的體內、體外研究中發現，MIF聯合順鉑作用于Hela細胞后，其細胞內順鉑的濃度較順鉑單獨作用時增加了2倍，同樣，裸鼠體內移植瘤中及血漿內順鉑的濃度也明顯升高，藥物的AUC曲線下面積及半衰期分別增加了17%和30%。研究[10]發現，MIF的代謝產物美他普利酮也具有類似的效果，可以增加細胞內藥物的濃度，從而增加細胞毒性。這種增敏作用對于耐藥細胞而言，在一定程度上能夠起到逆轉耐藥效果。在其他腫瘤，如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等的耐藥研究中均發現MIF具有逆轉耐藥的作用[2]。如Chen等[11]在宮頸癌的體外研究中發現，10 μmol/L的MIF可使Hela/MMC細胞對MMC的耐藥指數從5.02降至1.46。國內劉國艷等[12]在卵巢癌順鉑耐藥COC1/DDP細胞的體外研究中發現，隨著MIF濃度的增加，COC1/DDP細胞對順鉑的耐藥性逐漸下降，且在10 μmol/L的水平時，耐藥細胞對順鉑的敏感性可以達到并超過相應敏感株水平。國外研究[13]發現，5 μmol/L的MIF對卵巢癌細胞生長無影響，且能成功逆轉耐藥。本研究在MIF對SKOV3、SKOV3/DDP兩種細胞的細胞毒性作用的量—效曲線中同樣發現，5 μmol/L的MIF無論對耐藥細胞還是非耐藥細胞抑制率均<5%，且在耐藥細胞中該濃度與低濃度組相比細胞抑制率無明顯統計學差異，表明此濃度的MIF在耐藥細胞中無直接抑制瘤作用，主要是通過改善腫瘤細胞對DDP的敏感性，逆轉細胞的耐藥性。在乳腺癌耐藥MCF/ADM細胞中，黃俊輝等[14]發現逆轉劑量5 μmol/L的MIF可將細胞對ADM的耐藥指數下降約8.78倍。在將MCF/ADM細胞進行裸鼠體內移植形成移植瘤后，5 μmol/L的MIF與ADM聯合使用時裸鼠體內移植瘤的體積顯著低于單用ADM組的瘤體積。本研究也發現MIF作用于SKOV3/DDP細胞后，耐藥指數下降，隨著時間的延長，逆轉耐藥效果越強。

對腫瘤耐藥逆轉的研究歸根結底要從耐藥產生的機制上進行探索。以往關于MIF對腫瘤耐藥性逆轉的研究主要集中在耐藥基因及相關耐藥蛋白的表達上，如MIF能夠誘導P-gp表達降低，抑制藥物外排，逆轉耐藥。本研究則從凋亡的角度出發，探討MIF對細胞周期調節的影響。耐藥的腫瘤細胞常伴隨著細胞周期從G1期到S期過渡的增加[15]。Gaddy等[16]發現MIF單獨或與4-OHT聯合作用耐藥細胞系MCF-7.0.3及MCF-7.3.28后，與對照組相比，G1期比例明顯增加，S期減少，細胞周期受阻于G0/G1期。本研究中，5 μmol/L的MIF作用于SKOV3/DDP后，隨培養時間延長，細胞周期中G0/G1期所占的比例逐漸增加，S期所占的比例減少，表明細胞周期受阻于G0/G1期，這可能是MIF逆轉卵巢癌耐藥的原因。

綜上所述，加入5 μmol/L的MIF可抑制SKOV3/DDP的細胞增殖，5 μmol/L的MIF可減輕SKOV3/DDP細胞對DDP的耐藥性。MIF減輕SKOV3/DDP細胞對DDP的耐藥性機制可能為MIF可將SKOV3/DDP的細胞周期阻滯于G0/G1期。