異土木香內(nèi)酯對人膀胱癌細胞株T24增殖、凋亡的影響及其機制

樊成輝，張陽，姜華茂

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000

膀胱癌發(fā)病率占最常見惡性腫瘤的第10位[1]。近年來，膀胱癌的治療方法具有多樣性，包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)、根治性膀胱切除術(shù)、化療、免疫療法[2]。目前，國內(nèi)外膀胱癌的主要治療方法是手術(shù)聯(lián)合膀胱內(nèi)化療，經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除(TURBT)是多數(shù)膀胱癌的首選治療方法，但TURBT對術(shù)者的要求高，且手術(shù)治療后患者復(fù)發(fā)率和遠處轉(zhuǎn)移率均較高[3]。為降低腫瘤復(fù)發(fā)率，臨床常在手術(shù)切除腫瘤的同時聯(lián)合應(yīng)用化療，不良反應(yīng)較大[4]。目前，中藥在腫瘤治療中的藥用價值[5]已成為目前的研究熱點。異土木香內(nèi)酯主要來源于菊科植物土木香的根部，可促進多種惡性腫瘤的細胞凋亡。但是關(guān)于異土木香內(nèi)酯對膀胱癌凋亡的影響相關(guān)研究甚少。2019年3月～2020年2月，我們體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞株T24，觀察異土木香內(nèi)酯對T24細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞、材料和儀器 T24細胞購自上海富衡公司；培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃，濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞融合度80%～90%時0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天細胞傳代。異土木香內(nèi)酯(純度>98%)購自北京索萊寶公司，按照說明書，使用DMSO溶解異土木香內(nèi)酯配制成終濃度為80 nmol/L的母溶液，使用時稀釋相應(yīng)濃度，DMSO終濃度<0.1%。N-乙酰半胱氨酸(NAC，一種抗氧化劑)購自美國Sigma公司，將NAC粉末溶解于雙蒸水中，配置成1 mol/L的溶液，使用時培養(yǎng)基稀釋成5 nmol/L，母溶液均過濾除菌后-20 ℃保存?zhèn)溆谩C-1線粒體膜電位檢測試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、PBS溶液購自北京索萊寶公司；0.25%胰蛋白酶購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自日本同仁公司；活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天公司。兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3抗體購自美國CST公司；鼠單克隆β-Actin抗體購自美國Sigma；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購自北京博奧森公司；多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司；低溫高速離心機購自美國Thermo公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司；凝膠成像儀購自美國GE公司。

1.2 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期T24細胞，調(diào)整細胞密度1×105/mL，將其接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液。待細胞貼壁后，將細胞分為1、2、3、4、5、6組，1、2、3、4、5組(實驗組)分別加入5、10、20、40、80 μmol/L的異土木香內(nèi)酯，6組加入正常培養(yǎng)液(對照)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時，取各組細胞， 吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含10 μL的CCK-8試劑培養(yǎng)基100 μL，2 h后用酶標儀檢測各孔450 nm處光密度(OD)值，測算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)增殖抑制率進一步測算出異土木香內(nèi)酯作用24 h時T24細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為22.45 μmol/L，并將其用于后續(xù)實驗。

1.3 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期T24細胞，1×105/mL接種于6孔板中，待細胞貼壁后，將細胞分為A組(對照)、B組(5 nmol/L NAC)、C組(10 μmol/L異土木香內(nèi)酯)、D組(20 μmol/L異土木香內(nèi)酯)及E組(5 nmol/L NAC+20 μmol/L異土木香內(nèi)酯)，每組6個復(fù)孔。A組加入不含異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)液培養(yǎng)，B、E組先加入5 nmol/L的NAC預(yù)處理培養(yǎng)2 h，C、D、E組分別加入10、20、20 μmol/L的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)24 h。收集各組細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化離心收集細胞，PBS離心清洗2次。制細胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物和5 μL的PI Solution，室溫下避光培養(yǎng)15 min。加入400 μL 1×Annexin V Binding Solution，1 h內(nèi)流式細胞儀完成檢測，測算各組細胞凋亡率。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細胞活性氧簇(ROS)檢測 采用流式細胞術(shù)。參照“1.3”對細胞進行分組處理。制細胞懸液，加入500 μL預(yù)先稀釋的 DCFH-DA 熒光探針 37 ℃染色 ，避光孵育30 min，PBS洗2次后，采用流式細胞儀檢測各組細胞ROS含量水平，其平均熒光強度可間接反映ROS含量。熒光強度越高,反映ROS含量越多。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細胞線粒體膜電位檢測 采用JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位。參照“1.3”對細胞進行分組處理。制細胞懸液，加入1 mL細胞培養(yǎng)液和1 mL的JC-1染色液充分混勻，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，室溫下離心收集細胞，用JC-1 染色緩沖液(1×)清洗2次，吸取500 μL JC-1 染色緩沖液(1×)重懸細胞，采用流式細胞儀檢測線粒體膜電位。JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位，JC-1 聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi),形成聚合物為紅色熒光，即線粒體膜電位較高；JC-1不能形成聚合物而形成單體時為綠色熒光，即線粒體膜電位較低，計算JC-1綠色熒光單體所占百分比(間接反映線粒體膜電位變化),綠色熒光單體越多，反映線粒體膜電位越低。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細胞相關(guān)凋亡蛋白Bax、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、細胞色素C(Cytochrome C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期T24細胞分為4組，每組6個復(fù)孔，其中3組分別加入10、20、40 μmol/L異土木香內(nèi)酯，另外1組加入不含異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)液處理(對照組)，培養(yǎng)24 h時收集各組細胞，加入 0.1 mL 含有蛋白酶抑制劑的RIPA 細胞裂解液在冰上裂解30 min，低溫高速離心機中離心，取上清液，用BCA法測定總蛋白濃度，利用酶標儀測定吸光度值制定標準曲線，根據(jù)結(jié)果制樣。進行SDS-PAGE 電泳分離,冰浴下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上,采用 5%脫脂奶粉封閉 1 h, 兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3一抗(1:1 000稀釋)鼠單克隆β-Actin一抗(1∶10 000稀釋) 4 ℃孵育過夜,次日TBST清洗3次，二抗(1∶10 000稀釋) 孵育2 h，ECL采用化學(xué)發(fā)光顯影，通過凝膠成像檢測各組Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3蛋白。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時間各組細胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h時A、B、C、D、E組細胞凋亡率分別為6.59%±1.22%、8.53%±1.015、20.72%±2.11%、43.21%±2.20%、8.32%±2.78%,與A組比較，C、D組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與C組比較,D組細胞凋亡率升高(P<0.05);與D組比較，E組細胞凋亡率降低(P<0.05)。

2.3 各組細胞ROS含量比較 培養(yǎng)24 h時A、B、C、D、E組細胞ROS熒光強度分別為997±236、1 699±315、4 609±548、10 026±605、1 831±307，與A組比較，C、D組細胞ROS含量升高(P<0.05)；與C組比較,D組細胞ROS含量升高(P<0.05)；與D組比較，E組細胞ROS含量降低(P<0.05)。

2.4 各組細胞線粒體膜電位比較 培養(yǎng)24 h時A、B、C、D、E組細胞線粒體中綠色熒光單體百分比分別為11.30%±1.32%、12.34%±1.66%、27.19%±1.19%、52.61%±2.11%、21.94%±1.02%，與A組比較，C組細胞線粒體膜電位降低(P<0.05)；與C組比較,D組細胞線粒體膜電位降低(P<0.05);與D組比較，E組細胞線粒體膜電位升高(P<0.05)。

2.5 各組細胞Bax、 Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對表達量比較 各組細胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對表達量比較見表2。

表2 各組細胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對表達量比較

3 討論

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，每年估計有549 000例新發(fā)病例(占癌癥新發(fā)病例3%)和200 000例死亡病例(占癌癥死亡人數(shù)2%)。膀胱癌在男性中更為常見，其發(fā)病率和病死率分別為9.6/10萬和3.2/10萬，約是女性的4倍。膀胱癌的發(fā)病原因相當復(fù)雜，除了某些接觸化學(xué)和水污染的職業(yè)外，吸煙是膀胱癌發(fā)病的主要危險因素之一[6]。

植物用于癌癥治療的歷史悠久，已經(jīng)有3 000多種植物用于治療癌癥，人們不斷研究大自然中各種生物形式的提取物以尋找抗癌化合物[7]。研究膀胱癌分子靶點治療藥物仍然是當前一大熱點。異土木香內(nèi)酯屬倍半萜內(nèi)酯類化合物，提取自菊科旋覆花屬植物土木香的根部，具有廣泛的藥理學(xué)作用，作為治療癌癥的藥物具有巨大的潛力[8]。異土木香內(nèi)酯藥理學(xué)研究表明具有驅(qū)蟲、抗菌、抗真菌、抗腫瘤、抗炎、抗損傷、降血糖、止痛、保護神經(jīng)等效果[9，10]。在此,我們主要研究異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)T24細胞增殖、凋亡的初步機制。

細胞的增殖和細胞凋亡的相對穩(wěn)定對維持人體功能非常重要。因此,誘導(dǎo)細胞增殖和細胞凋亡機制相關(guān)研究已成為了抗腫瘤研究的熱點。線粒體是真核細胞生物進行氧化代謝的細胞器,不僅為各種細胞的生命活動提供能量,而且參與了多種生物學(xué)過程，在能量代謝過程中線粒體產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在信號傳導(dǎo)和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[11]。ROS通常被認為是氧消耗和細胞代謝的副產(chǎn)品，主要由正常細胞中的線粒體氧代謝產(chǎn)生，是參與維持細胞內(nèi)環(huán)境的重要分子，包括超氧基(O2·)、羥自由基(OH)、過氧化氫(H2O2)、單氧分子等[12]。一定情況下，細胞內(nèi)ROS含量能夠體現(xiàn)氧化還原的程度，從而決定細胞的存活，在低濃度下，ROS誘導(dǎo)正常細胞和癌細胞增殖以及存活, 在中等濃度時，ROS可以誘導(dǎo)暫時或永久的細胞周期阻滯并促進細胞分化, 然而，在較高濃度下，ROS會破壞蛋白質(zhì)、DNA、RNA等細胞生物分子，并導(dǎo)致突變從而促進正常細胞或癌細胞凋亡[13]。ROS還可以作為激活線粒體途徑的信號通路的第二信使，可以激活線粒體內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)中蛋白Bcl-2家族，Bcl-2家族成員包括促凋亡蛋白因子Bax和抗凋亡蛋白因Bcl-2因子[14]。ROS通過下調(diào)線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白表達，促使促凋亡因子Bax轉(zhuǎn)位到線粒體上，引起線粒體膜過氧化破壞,誘導(dǎo)細胞內(nèi)線粒體膜電位下降,啟動線粒體途徑的凋亡過程，誘導(dǎo)Cytochrome C的大量釋放進入胞質(zhì)中，活化Caspase蛋白酶家族,引起細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng),使細胞進入不可逆的凋亡過程[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨異土木香內(nèi)酯藥物濃度增加，細胞增殖抑制明顯，細胞凋亡率升高，細胞內(nèi)ROS含量顯著增加，JC-1綠色熒光單體的熒光強度增強。應(yīng)用ROS清除劑NAC后，可以減弱異土木香內(nèi)酯對人膀胱癌T24細胞凋亡率、細胞內(nèi)ROS含量、線粒體膜電位的影響。說明了異土木香內(nèi)酯在引起T24細胞ROS的大量積聚后,ROS引起了線粒體膜的過氧化破壞,導(dǎo)致細胞凋亡率上升，細胞內(nèi)線粒體膜電位下降,啟動了細胞線粒體途徑的凋亡過程。 蛋白印跡實驗結(jié)果表明異土木香內(nèi)酯能上調(diào)Bax、Cytochrome C、Caspase-3相對表達量，下調(diào)Bcl-2相對表達量，從而發(fā)揮其抗癌作用。

綜上所述,異土木香內(nèi)酯可抑制T24細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制可能為異土木香內(nèi)酯作用T24細胞后，提高細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,降低細胞線粒體膜電位，促進Bax、Cytochrome C、Caspase-3表達。異土木香內(nèi)酯對其腫瘤的作用機制及其在人體內(nèi)的藥理作用有待進一步研究,有望開、作用發(fā)成為以線粒體凋亡途徑為靶點的新型抗腫瘤藥。