熊果酸預處理對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌病理改變的影響

王金艷 肖亞利 陳麗東 宋 紅 趙 敏 王國龍

急性心肌梗死(acute myocadical infraction，AMI)是臨床上較為常見的急危重癥和心源性猝死的主要原因，具有起病急、病情進展迅速的特點，多數患者無法在最佳治療時間窗內得到有效救治，因此研發出能夠有效緩解AMI疾病進展的藥物將具有重要的臨床意義[1]。熊果酸(ursolic acid，UA)是天然存在于杜鵑花科灌木熊果中的一種五環三萜類化合物，能夠通過抑制鈣超載對缺血性腦損傷起到保護作用，而鈣超載是AMI后心肌組織和細胞不可逆損傷的重要病理機制[2,3]。因此本研究通過造模前3天開始給予UA預處理，并以鈣通道阻斷劑維拉帕米(verapami，Ver)為陽性對照藥物，研究UA對AMI后心功能及心肌組織病理改變的影響。

材料與方法

1.材料：(1)藥物與試劑：UA購自上海玉博生物科技有限公司(純度≥98%)；Ver購自黑龍江多多藥業有限責任公司(規格2ml:5mg)；NBT購自上海前進試劑廠；TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。(2)實驗動物：180只SPF級雄性SD大鼠，體質量230±20g，購自河北省實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK(冀)2018-004]，適應性飼養7天后進行實驗(亮暗時間1∶1、室溫25±1℃、相對濕度65%±5%)。

2.動物分組、給藥預處理與造模：(1)分組與給藥預處理：180只大鼠數字編碼后按照數字表法隨機分為假手術組(Sham組)，AMI組，UA低、中、高劑量(10、20、40mg/kg)組和Ver(2.5mg/kg)預處理組，每組30只。精確稱取UA并加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度10、20、40mg/ml的UA溶液；UA低、中、高劑量預處理組分別于造模前3天開始1次/天腹腔注射給予10、20、40mg/ml的UA溶液，Ver預處理給予Ver溶液，Sham組和AMI組給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為1ml/kg。(2)造模：參照吳慶景等[4]報道的方法，通過結扎左冠狀動脈前降支復制AMI大鼠模型；結扎后左心室心肌蒼白，心電圖ST段持續抬高或T波高聳即可判斷造模成功。假手術組除不結扎左冠狀動脈前降支外，其余操作同AMI組。

3.心功能指標和心肌梗死體積檢測：①每組隨機取10只大鼠，通過心臟超聲多普勒檢測左心室舒張、收縮末期內徑(LVIDd、LVIDs)、射血分數(EF)和每搏排出量(SV)，連續檢測5個心動周期取平均值；②頸椎脫臼處死，取心臟置-20℃冰箱凍存0.5h，取左心室并沿房室溝方向平行切為5片，置2% NBT溶液37℃避光孵育1h，通過圖像分析系統計算心肌梗死體積。

4.心肌組織病理學檢查及評分：每組大鼠按照數字表法隨機取10只，麻醉后開胸，取心臟組織并切取左心室，置4%多聚甲醛溶液固定72h后行石蠟包埋、4μm厚度切片、二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟后，行HE染色，通過光學顯微鏡觀察心肌組織病理學改變。損傷評分：由兩名實驗人員參照葉蘭等[5]報道的方法獨立評分后取平均值：正常心肌計0分，病變視野比例≤1/4計1分、1/4～1/2計2分、≥1/2計3分，從變性壞死、出血、間質水腫、炎性細胞浸潤4方面評分，總和即為損傷評分。

5.細胞凋亡檢測：石蠟切片經二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟水化處理后，參照TUNEL試劑盒說明進行染色處理，通過光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況。凋亡指數(apoptosis index, AI)計算：每張切片分別由兩名實驗人員隨機取5個不重疊視野計數凋亡細胞數和細胞總數，AI(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

6.心肌細胞超微結構檢測：各組取剩余的10只大鼠，頸椎脫臼處死后開胸取心臟，取左心室并切割成5mm3方塊，4%戊二醛溶液4℃固定24h、1%鋨酸4℃固定3h，梯度乙醇和無水丙酮脫水、氧化丙烯置換和環氧樹脂包埋后，70nm厚度超薄切片，經醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后通過透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構。

結 果

1.各組大鼠心功能指標比較：與Sham組比較，AMI組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高而EF、SV顯著降低(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預處理組LVIDd、LVIDs降低且EF、SV升高(P<0.05或P<0.01)；與Ver預處理組比較，UA高劑量預處理組LVIDs降低且SV升高(P<0.05或P<0.01,表1)。

表1 各組大鼠心功能指標比較

2.各組大鼠心肌梗死體積比較：與Sham組比較，AMI組心肌梗死體積顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預處理組梗死體積降低(P<0.01)；與Ver預處理組比較，UA高劑量預處理組梗死體積降低(P<0.01，表2)。

表2 各組大鼠心肌梗死體積、損傷評分、AI比較

3.各組大鼠心肌組織病理學改變及損傷評分比較：Sham組大鼠左心室心肌組織形態結構未見異常；AMI組呈現心肌纖維部分斷裂，細胞數量減少、排列紊亂，胞核固縮、偏移，間質水腫，大量炎性細胞浸潤等病理改變；與AMI組比較，UA各劑量和Ver預處理組上述形態結構改變呈不同程度減輕，其中UA高劑量預處理組未見心肌纖維斷裂、間質水腫不明顯。與Sham組比較，AMI組大鼠心肌損傷評分顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA中、高劑量和Ver預處理組損傷評分降低(P<0.05或P<0.01)；與Ver預處理組比較，UA高劑量預處理組損傷評分降低(P<0.05,圖1,表2)。

4.各組大鼠心肌細胞凋亡比較：Sham組心肌可見少量凋亡細胞；與Sham組比較，AMI組凋亡細胞數量明顯增多、AI顯著升高(P<0.01)；與AMI組比較，UA低、中、高劑量和Ver預處理組凋亡細胞數量明顯減少，AI降低(P<0.01)；與Ver預處理組比較，UA高劑量預處理組AI降低(P<0.01,圖2,表2)。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變比較(HE，×200)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預處理組；D.UA中劑量預處理組；E.UA高劑量預處理組；F.Ver預處理組

5.各組大鼠心肌細胞超微結構改變比較：Sham組染色質分布均勻、線粒體結構清晰，未見異常；AMI組呈現平滑肌絲溶解斷裂，染色質固縮，核仁邊界不清，線粒體膜破裂、嵴變短、嵴溶解消失等超微結構病變；UA各劑量和Ver預處理組上述超微結構病變呈不同程度減輕，其中UA高劑量預處理組心肌纖維少量斷裂，染色質分布均勻，線粒體結構完整,詳見圖3。

討 論

隨著人民生活水平的提高以及人口老齡化的加劇，AMI發生率呈逐年上升趨勢[6]。近年來中醫藥防治AMI得到廣泛關注，熊果酸是可藥用植物熊果的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多種生物學活性[7～9]，而氧化應激、炎性反應以及繼發性細胞凋亡在AMI病理變化過程中發揮著重要作用[10～12]。本研究結果顯示，經UA預處理能夠明顯降低AMI大鼠LVIDd、LVIDs并升高EF、SV，降低左心室心肌梗死體積；明顯改善心肌纖維斷裂，胞核固縮、偏移，間質水腫，炎性細胞浸潤等病理性改變，并且UA高劑量預處理組作用優于Ver預處理組，提示UA預處理對AMI大鼠心功能和心肌病理學改變具有保護作用。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡比較(TUENL，×400)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預處理組；D.UA中劑量預處理組；E.UA高劑量預處理組;F.Ver預處理組

圖3 各組大鼠心肌細胞超微結構改變比較(透射電子顯微鏡，×10000)A.Sham組；B.AMI組；C.UA低劑量預處理組；D.UA中劑量預處理組；E.UA高劑量預處理組;F.Ver預處理組

心肌細胞具有不可再生性，因此挽救心肌梗死區半暗帶細胞是改善AMI患者預后的關鍵[13]。細胞凋亡是一種程序化自主死亡過程，對維持生理狀態下細胞新陳代謝具有重要作用，但病理性刺激心肌細胞過度凋亡在AMI疾病進展過程中發揮著重要作用[14,15]。線粒體膜通透性改變導致細胞色素C釋放入細胞質，將啟動線粒體介導的內源性凋亡途徑[16，17]。本研究發現，AMI大鼠左心室心肌細胞凋亡數量明顯增多，與張顯純等[18]、袁輝等[19]研究結果一致；梗死區心肌細胞呈現肌絲溶解斷裂，線粒體膜破裂、嵴斷裂溶解等超微結構病變，與張麗麗等[20]研究結果一致。經UA預處理能夠明顯抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡并降低AI，抑制心肌細胞線粒體細胞器等超微結構病變，UA高劑量預處理組上述作用優于Ver預處理組，提示UA對AMI大鼠心肌細胞凋亡和細胞超微結構病變具有抑制作用。

綜上所述，UA預處理對AMI大鼠心功能和左心室心肌病理學改變及細胞超微結構病變具有保護作用，但其作用機制還有待于進一步研究。