hsa_circ_0006411慢病毒載體的構建及驗證

盧 韜 董學君

非編碼RNA是指一類不能編碼蛋白質的RNA類型(近年來發現有些非編碼RNA也具有編碼肽功能)，包括微小RNA、長鏈非編碼RNA和環狀RNA等類型[1,2]。環狀RNA是由mRNA前體反向剪接產生的閉合環狀結構，雖然大多數不能編碼蛋白質，但卻可以通過一系列機制調節相關基因的表達，來發揮細胞學功能，在癌癥中也具有重要的調控作用[3]。PIK3R1基因可編碼p85a蛋白，作為磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路中PI3K的調節亞基，在諸如乳腺癌，宮頸癌等實體瘤中顯著低表達，其可與PTEN結合，從而增強PTEN的脂質磷酸酶活性，發揮抑癌作用[4～6]。本研究發現，來源于PIK3R1母基因的環狀RNA(hsa_circ_0006411)在多種實體瘤組織中低表達，為了研究其功能，擬構建其慢病毒載體，并驗證實用性后，用于后續的細胞實驗。

對象與方法

1.試劑與儀器：In-Fusion?HD 克隆試劑盒(日本TaKaRa公司)，膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒(美國Omega公司)，pLC5-ciR載體(廣州吉賽公司)，RPMI1640培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國ExCell Bio公司)，脂質體2000(美國Invitrogen公司)；儀器主要有PCR儀(德國羅氏公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)和冷凍離心機等。

2.載體構建及測序鑒定：(1)目的片段擴增：設計帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的引物，序列見表1，以人細胞混合樣本cDNA為模板擴增環狀RNA hsa_circ_0006411，目的片段在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳后，按照膠回收試劑盒操作說明回收純化目的片段。(2) 目的片段與載體連接：分別向目的片段和載體pLC5-ciR中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶，得到的產物連接成攜帶circ_0006411的pLC5-ciR表達載體。該表達載體轉化感受態細胞，陽性菌落擴增后行PCR測序，與BLAST序列比對，看是否為目的hsa_circ_0006411 RNA序列；并比對測序得到的環化接頭位點與circbase中的環化位點序列，看是否完全一致，測序引物列見表1。

3.hsa_circ_0006411載體的驗證：293T細胞接種于6孔板中，當細胞80%匯合時轉染，分成hsa_circ_0006411載體、PLC5-ciR空載體及對照組分別轉染293T細胞，培養6h后換液，更換為完全培養基，40h以后觀察細胞GFP的表達，并收集細胞，PCR擴增檢測circ_0006411的表達情況，以GAPDH為管家基因，2-ΔΔCT表示irc_0006411的相對表達量，引物序列見表1。

表1 各基因引物表

結 果

1.載體測序結果：構建的PLC- hsa_circ_0006411載體經轉化感受態細胞后，可在LA平板上檢測出陽性菌落，該菌落PCR產物測序結果如圖1，經BLAST序列比對后發現，與GenBank上的人hsa_circ_0006411序列完全一致，測序后得到的環化接頭位點與circbase中的環化位點序列也完全一致(圖1)，載體構建成功。

圖1 hsa_circ_0006411部分測序圖及環狀位點測序圖A.hsa_circ_0006411測序結果部分顯示的圖譜；B.hsa_circ_0006411環化位點處的顯示圖

2.轉染293T細胞后hsa_circ_0006411表達量及測序結果：轉染293T細胞后hsa_circ_0006411載體組、PLC5-ciR空載體及對照組相對表達量分別為9947.08±514.42、3.71±0.71和1.00±0.10，差異有統計學意義(圖2)，其擴增曲線見圖3；顯微鏡下可見在293T細胞中的綠色熒光蛋白的表達，表明hsa_circ_0006411載體可在293T細胞中穩定表達circ_0006411環狀基因。

圖2 轉染293T細胞后基因表達情況

圖3 hsa_circ_0006411 PCR擴增曲線黃色為GAPDH基因，其他為circ_0006411基因

討 論

環狀RNA在1976年首次在病毒中被發現[7]。作為非編碼RNA群體的一個重要組成部分，其形成機制為線狀mRNA前體物質反向剪接形成的環狀結構，其5′和3′末端通過磷酸二酯鍵連接，而不形成懸空的自由末端，相對于線性結構而言，其環狀結構使得其能夠更加穩定的表達存在于組織、血液及其他體液中[8,9]。由于其非編碼特性，在生物體生命活動，疾病發展過程中的作用一直以來都被忽視。直到近年來發現很多非編碼RNA的重要調控基因表達的功能被提出，才對circRNA的研究重新引起重視。加上現代生物技術和研究工具的發展，越來越多的研究表明，circRNA在人類生命活動過程中的重要作用，目前而言主要體現在以下幾個方面：①作為競爭性內源RNA(ceRNA機制，即競爭性結合miRNA，從而解除對與其結合的靶基因的抑制作用，來提高miRNA靶基因表達)來調控特異性基因的表達[10,11]；②與RNA結合蛋白相互作用來抑制或調控該蛋白的活性[12,13]；③通過順式/反式作用與RNA直接結合來調控RNA的水平[14,15]；④可以作為模板翻譯成多肽[16～18]。上述circRNA的穩定性特征及諸多功能，賦予其作為腫瘤發生、發展、診斷和治療等多種路徑分子的可能性，科學家的確發現其與肺癌、乳腺癌、泌尿生殖系統和消化系統等幾乎所有癌種的密切關系。

本研究主要為肺癌相關的環狀RNA的研究。前期研究發現，在肺癌組織中相對于癌旁組織低表達的circ_0006411,其母基因為編碼PI3K信號通道中調節亞基P85a的基因PIK3R1，該基因在不同腫瘤中的表達高低具有明顯的組織特異性，在乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌和非小細胞肺癌中明顯低表達，其可能主要是發揮抑制PI3K/AKT下游的動物雷帕素靶蛋白(mTOR)信號轉導通路來抑制腫瘤的增殖，促進凋亡的作用[19,20]。今后擬進一步研究circ_0006411在非小細胞肺癌中的作用機制，需先構建該環狀RNA的載體。本研究以慢病毒載體PLC5-ciR為工具，通過基因工程的手段，成功構建了攜帶該環狀基因的慢病毒載體，并在293T細胞中能顯著高表達，可以用于后續實驗。