血漿及腸源性脂多糖濃度與藏族人群冠心病的關系

劉鳳云 李 媛 馬 焱 侯海文 李愈嫻 談月琴

冠心病(coronary heart disease,CHD)仍是人類健康的主要威脅[1]。2型糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝性疾病是其危險因素，以亞臨床炎癥狀態為特征[2,3]。雖然慢性炎性標志物如C反應蛋白可以預測動脈粥樣硬化的發展，但負責慢性炎癥啟動和維護的因素仍有待闡明[4]。近年來研究表明，代謝疾病存在腸道菌群改變及腸源性脂多糖(即內毒素，lipopolysaccharide， LPS)的吸收，LPS是革蘭陰性菌細胞壁的成分，可以從腸道菌群易位出現在血液循環[5]。這種代謝性內毒素血癥，與外源性細菌感染或敗血癥引起的其他類型內毒素血癥不同，長期的高脂肪飲食可能導致內毒素血癥和低級別炎癥,與冠心病的發生密切相關[2,3,6]。藏族居住地高寒缺氧，飲食多以高蛋白高脂肪為主，作為高原適應民族，具有獨特的適應環境和飲食的腸道菌群[7，8]。冠心病人群與正常人群比較是否存在LPS從腸道菌群易位出現在血液中而產生內毒素血癥和低炎性反應,與CHD的相關性如何少有報道。本研究以藏族CHD人群為研究對象，分析血液與腸源性LPS的關系，判別LPS與CHD人群血脂紊亂與低炎性反應的相關性，為藏族CHD患者個性化醫療提供支持。

對象與方法

1.研究對象:研究采用橫斷面研究(cross-sectional study)方法,經青海省心腦血管病專科醫院醫學倫理學委員會審查同意，作為藏族冠心病患者腸道菌群組成及與血生化指標相關性研究項目(2017-ZJ-720)的一部分開展研究。選擇2017年8月～2018年2月就診于該院冠心病科的可疑CHD并接受心臟CT和冠脈造影檢查的患者60例為研究對象，其中，男性50例，女性10例，患者年齡31～80歲，平均年齡58.3±11.92歲。根據檢查結果將患者分為CHD組31例(至少1根主要冠狀動脈血管或其分支狹窄超過50%)和患者對照組29例(NCHD組，無冠脈狹窄或冠脈狹窄小于50%者)。納入標準：年齡25～80歲，3000米及以上的世居藏族，近期有心絞痛或類似心絞痛發作，接受冠狀動脈造影或冠脈CT檢查及靜脈血檢測標本采集。排除標準：出血性腦卒中者，嚴重的肝、腎功能異常者，嚴重的心力衰竭者，惡性腫瘤者，感染或活動期免疫疾病以及完善相關檢查后考慮以上疾病者。另外選取身體健康，排除冠心病、高血壓、糖尿病等心血管病史，嚴重或沒有控制的慢性病的3000米及以上世居藏族為健康對照組，其中男性11例，女性16例，平均年齡42.30±9.58歲。本研究所有入選患者均簽署書面知情同意書。

2.實驗室檢測:患者入院后分別用普通生化管和EDTA抗凝管采集空腹靜脈血液，在4℃、3000r/min條件下離心10min，留取血清及血漿，另收集清晨早餐前的新鮮糞便樣本并分裝于凍存管中, 分別將血液和糞便樣品置于-80℃冰箱中保存。應用全自動血液生化分析儀(Olympus Au2700)對血脂、C反應蛋白(CRP)等指標進行檢測，白細胞計數采用血細胞分析儀(日本Sysmex公司，型號Sysmex XT-1800i)。采用雙抗體一步夾心ELISA試劑盒檢測糞便和血漿樣品中LPS濃度。糞便樣本處理按照10mg樣本加100μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的比例稀釋。用酶標儀(Rayto RT-6100)在450nm的微板上測量吸光度(A值)，繪制標準曲線，計算樣品LPS濃度。

結 果

1.一般情況：同健康對照組比較，藏族CHD患者組和患者對照組年齡、性別與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，因此將年齡和性別作為校正因素進行了協方差分析。結果發現，CHD組CRP、WBC水平顯著高于NCHD和HT組， CHD組HDL-C水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 參與者一般情況表

2.參與者血液及腸源性LPS水平比較：與HT組比較，CHD和NCHD組血漿和腸源性LPS水平均顯著升高，差異有統計學意義(P=0.000),詳見表2。

3.藏族LPS水平與前述差異性指標的相關性:以年齡和性別為控制變量，對藏族LPS水平與前述差異性指標相關性進行分析，發現血漿LPS水平與糞便LPS水平顯著相關(r2=0.6496,P=0.000)，分別與CRP、WBC水平呈正相關(血漿CRP:r2=0.1347,P=0.006；WBC：r2=0.0864,P=0.031;糞便CRP：r2=0.1697,P=0.002; WBC:r2=0.1756，P=0.002)，與HDLC、TG水平均不相關(表3)。

表2 血液及糞便LPS、血脂及炎性因子比較

表3 藏族人群LPS水平與血脂、CRP等指標的相關性

4.多因素分析糞便LPS與藏族CHD的關系:以分組為因變量，健康對照HT組為參考類別，以LPS、性別、年齡、CRP、WBC計數等為協變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果詳見表4。在排除上述差異性因素的影響外，糞便LPS濃度依然與藏族CHD有關聯(OR=1.614,P<0.05)。

表4 多因素Logistic分析LPS與CHD的關系

討 論

紊亂的脂質代謝和慢性低炎性反應是冠心病主要發病機制[2,3]。長期的高脂飲食可能導致內毒素(lipopolysaccharide， LPS,即脂多糖)血癥和低級別炎癥，可增加胰島素抵抗和動脈粥樣硬化的風險[6]。藏族人群日常攝入脂肪蛋白質較多，但其又是高原適應民族，冠心病人群與正常人群比較是否也存在內毒素血癥和低炎性反應？筆者的研究表明與正常藏族人群比較，藏族冠心病人群糞便LPS水平比正常人群顯著升高3.6倍(38.48±5.16pg/g vs 10.68±4.62pg/g),是冠心病人群血漿LPS水平的6.7倍，是正常人群血漿LPS水平的14倍。白細胞計數顯著升高[(9.20±4.68)×109/L vs (5.95±1.47)×109/L]，C反應蛋白也顯著增加(29.30±44.93mg/L vs 4.85±2.67mg/L)，這些結果說明相對于正常人群來說，藏族冠心病患者機體確實也存在著內毒素血癥和系統性低炎性反應。與天津地區CHD人群(默認漢族)比較，藏族正常人群和CHD人群血液中LPS水平處于非常低的水平(正常人群：漢族39.43±7.13pg/ml vs 藏族2.65±0.68pg/ml；CHD人群：漢族52.14±9.22pg/ml vs 藏族5.70±0.69pg/ml)，漢族腸源性LPS水平未見報道[6]。血液內毒素水平是評判機體腸道黏膜屏障功能的主要指標[9]。藏族正常和CHD人群血漿內毒素水平均遠低于低海拔正常漢族，說明藏族腸道黏膜屏障功能可能要優于漢族，也說明藏族人群的腸道已經適應了高脂肪高蛋白的飲食習慣，以漢族人群的LPS水平來評判藏族可能是不適宜的。另外，Faeh等[10]報道瑞士高海拔地區冠心病和腦卒中病死率較低，李正等[11]也報道藏族冠心病病死率較低。藏族血漿和腸源性LPS較低也可能是一個證據。

進一步的研究發現，相關性分析表明血漿LPS水平與糞便LPS水平顯著相關(r=0.806，P=0.000)，與CRP、WBC 水平也顯著相關，但是糞便LPS水平的改變對血液LPS水平改變的最大貢獻率為64.96%(r2=0.6496)，對CRP、WBC水平改變的貢獻率只有16.97%(r2=0.1697)和17.56%(r2=0.1756),說明血液LPS主要來源于腸道，藏族CHD患者腸道屏障的通透性可能發生了改變，革蘭陰性菌外膜釋放入腸道和血液的LPS顯著增加，而不是外源性細菌感染或敗血癥引起的血液LPS增加。這種改變觸發了機體免疫系統，進而引起CRP、WBC等炎性因子升高，是機體綜合反應的結果。

通常正常人體內少量LPS 可以在肝內與脂蛋白結合(尤其是高密度脂蛋白HDL)脫毒后排出體外[12]。腸道有益菌和有害菌比例失衡，使得革蘭陰性菌釋放LPS增加，與脂蛋白結合進入肝臟解毒的LPS增加，運輸膽固醇進入組織利用的HDL水平不足，從而導致膽固醇在血管壁的沉積增加[13,14]。本研究結果表明,藏族CHD患者HDLC水平是降低的，但LPS與HDLC水平不相關，說明藏族CHD患者血脂紊亂與糞便LPS并不直接相關。藏族人群日常攝入脂肪蛋白質較多，可能是CHD患者HDL-C改變的主要原因[7]。

研究認為血液LPS是冠心病機制性生物學標志物，認為LPS可誘導泡沫細胞的形成并促進膽固醇酯在低密度脂蛋白累積，促進動脈粥樣硬化，LPS濃度越高,動脈內膜厚度越厚[15，16]。CRP也與冠脈病變相關[4]。本研究表明，在排除性別、血液LPS、CRP、WBC等差異性指標的影響后，糞便LPS濃度依然是一個有意義的藏族CHD風險因子。但因藏族人群住院冠心病患者較少、樣本量小、未考慮他汀類等藥物應用的影響而使本研究具有一定的局限性。藏族腸源性LPS濃度與 CHD 之間的關系及機制仍有待于進一步研究。