甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用分析

嚴(yán)建文

癲癇是以慢性反復(fù)發(fā)作為基本特征的腦功能失調(diào)綜合征，且患病率在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦卒中。患者通常表現(xiàn)為意識(shí)突然喪失，部分患者伴有肌肉強(qiáng)直性收縮、口吐白沫現(xiàn)象。癲癇疾病的病因類(lèi)型較多，大腦皮質(zhì)病變、遺傳因素、腦損傷、顱腦疾病等都會(huì)引起癲癇。此類(lèi)患者生活質(zhì)量較低，缺乏必要的生活自理能力。另外癲癇反復(fù)發(fā)作會(huì)直接影響到神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元受損。受損后的神經(jīng)元具備過(guò)度的興奮性，易導(dǎo)致凋亡和壞死，使得癲癇灶區(qū)域神經(jīng)元脫失，例如比較多見(jiàn)的海馬神經(jīng)元脫失情況。因此探討癲癇發(fā)病機(jī)制與治療措施具有明確的現(xiàn)實(shí)意義。甘草酸作為活性三萜皂苷類(lèi)物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)的功能，可以在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮作用，所以本次研究也是以此為基礎(chǔ)而展開(kāi)。詳細(xì)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究時(shí)間為2019 年1—2 月，選擇20 只雄性大鼠，對(duì)其腹腔內(nèi)注射氯化鋰，在24 h 后繼續(xù)注射1 mg/kg 阿托品，將其作為研究的癲癇模型。其中10 只劃分為觀察組，在造模成功后從胃部灌入甘草酸，另外10 只劃分為對(duì)照組，造模成功后灌注生理鹽水。

大鼠體重平均（200±9.6）g，4 周齡，全部購(gòu)于某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。研究開(kāi)始前其生活溫度控制在23 ℃左右，自由進(jìn)食飲水，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則給予基礎(chǔ)的人道關(guān)懷。

試劑儀器包括caspase 3 和caspase 9 活性檢測(cè)試劑盒、熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 所有大鼠腹腔注射127 mg/kg 氯化鋰，24 后腹腔注射1 mg/kg 阿托品與30 mg/kg 匹魯卡品，按照癲癇發(fā)作Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，在IV 級(jí)以上代表大鼠處于癲癇狀態(tài)。大鼠癲癇持續(xù)發(fā)作時(shí)使用地西泮進(jìn)行控制，避免癲癇模型死亡[1-2]。

1.2.2 給藥 觀察組大鼠經(jīng)胃部灌入30 mg/kg 的甘草酸，連續(xù)用藥時(shí)間7 d。之后將觀察組和對(duì)照組大鼠全部實(shí)施麻醉，從腦組織中鈍性分離雙側(cè)海馬組織保存于液氮之中。

1.2.3 檢測(cè) 海馬組織切片后放置在二甲苯中，按照TUNEL反應(yīng)試劑盒步驟進(jìn)行石蠟切片HE 染色，觀察經(jīng)TUNEL 染色的陽(yáng)性細(xì)胞是否呈現(xiàn)出棕色，判斷細(xì)胞凋亡情況。將海馬組織勻漿后加入胰蛋白酶進(jìn)行裂解，離心后收集上清液并檢測(cè)海馬組織中的caspase 3，caspase 9 活性。

1.3 觀察指標(biāo)

以神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和caspase 3，caspase 9 活性差異作為甘草酸是否發(fā)揮功能的判定依據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究中的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)對(duì)比以t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)判定數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞

研究結(jié)果表明，觀察組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量要大于對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，證實(shí)了甘草酸在神經(jīng)元細(xì)胞損傷方面的抑制效果。如圖1、圖2 所示。

圖1 觀察組神經(jīng)元細(xì)胞（×100）

圖2 對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞（×100）

2.2 caspase 3，caspase 9 活性

觀察組大鼠的caspase 3，caspase 9 活性均要顯著優(yōu)于對(duì)照組，數(shù)據(jù)結(jié)果差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳細(xì)caspase 3，caspase 9 活性測(cè)定結(jié)果如表1 所示。

3 討論

癲癇是多種因素所導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元過(guò)度放電從而引起的反復(fù)發(fā)作中樞系統(tǒng)疾病，且近年來(lái)的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)[3]。在相關(guān)研究中提到以匹魯卡品為基礎(chǔ)構(gòu)建的癲癇動(dòng)物模型可以和人類(lèi)具有相似的神經(jīng)元細(xì)胞特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷等病理改變的研究，可以為癲癇疾病的發(fā)作和治療提供參考依據(jù)[4]。

癲癇本身具有復(fù)雜的病理生理機(jī)制，在癲癇發(fā)作后可以測(cè)定血腦屏障滲透性標(biāo)記物增加，在血腦屏障完整性遭到破壞后，神經(jīng)元變性等腦損傷情況會(huì)加速疾病的發(fā)展與惡化[5]。本次研究中，觀察組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量要大于對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，觀察組大鼠的caspase 3，caspase 9 活性也要顯著優(yōu)于對(duì)照組。說(shuō)明TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)了甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬損傷神經(jīng)元細(xì)胞方面的保護(hù)功能，這與傳統(tǒng)研究中有關(guān)阿爾茨海默病的結(jié)果比較接近[6-7]。細(xì)胞代謝的能量來(lái)源為線粒體，當(dāng)癲癇導(dǎo)致線粒體功能障礙后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)因此而增加，加速神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。線粒體在凋亡信號(hào)的影響刺激下，CtyC 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，和蛋白酶激活因子發(fā)生反應(yīng)后，caspase 3 接收凋亡信號(hào)，DNA 斷裂[8]。甘草酸被證實(shí)具有增強(qiáng)人體免疫功能的效果，在醫(yī)藥行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。在相關(guān)研究中也提到了炎性因子表達(dá)增加是導(dǎo)致血腦屏障破壞的主要因素，而甘草酸可以減少腦組織損害程度[9-10]。細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白調(diào)控之間存在密切聯(lián)系，癲癇的發(fā)病機(jī)制中也涉及到了這一部分的內(nèi)容。而本次研究也進(jìn)一步地研究分析了甘草酸對(duì)線粒體途徑有關(guān)蛋白表達(dá)的影響，成功地控制了神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象[11-12]。

表1 兩組大鼠海馬組織測(cè)定數(shù)據(jù)（±s，U/mg）

表1 兩組大鼠海馬組織測(cè)定數(shù)據(jù)（±s，U/mg）

組別 n Caspase 3 觀察組 10 1.31±0.09 對(duì)照組 10 0.81±0.07 ?Caspase 92.55±0.17 0.74±0.14 t 值 - 3.568 3.790 P 值 - 0.001 <0.001

綜上所述，甘草酸可以控制癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元損傷改善，促進(jìn)細(xì)胞活性的增加，為甘草酸在癲癇疾病的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。