LncRNA SNHG5、miR-26b在NSCLC組織中的表達及意義

李倩,楊在亮,賀煒

1重慶市第六人民醫院,重慶 400060；2重慶市中醫院

肺癌是全球人類癌癥死亡的主要原因之一。據統計，2018年美國肺癌死亡人數約為15萬余人[1]。肺癌主要分為兩類，小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)。NSCLC又分為鱗癌、腺癌和大細胞癌。據報道，美國每年新發現23萬病例中，有84%為NSCLC[2]，其主要臨床表現為咳嗽、痰中帶血。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一個長度為200 bp的轉錄本，其編碼蛋白質的能力較低，與多種癌癥的生物學標志物活性相關，如LncRNA-TDRG1在宮頸癌中高表達，并且在細胞生長周期、細胞分化過程中發揮重要作用[3]。最近研究證實，LncRNAs參與多種腫瘤疾病的發生發展，如卵巢癌、胃癌[4]。核仁小RNA宿主基因5(SNHG5)被證實與多種腫瘤的發生發展有關，如胃癌[5]。Damas等[6]發現，在結直腸癌組織中SNHG5表達上調，并且與腫瘤的惡性進展和不良生存呈正相關。微小RNA(miRNA)是長度為20～22個核苷酸的非編碼RNA，與多種腫瘤的發生發展有關，如食管癌[7]。通常情況下，miRNA可與靶基因的3′-UTR結合，從而促進癌細胞的增殖、遷移[8]。研究發現，miR-26b靶向作用于巖藻糖基轉移酶FUT4，從而抑制癌細胞的侵襲和遷移[9]。目前，LncRNA SNHG5與miR-26b在NSCLC中的具體作用機制尚不清楚。2013年1月—2016年12月，我們檢測了NSCLC組織中LncRNA SNHG5與miR-26b表達，探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期于重慶市第六人民醫院住院治療的NSCLC患者88例。納入標準：①經活檢病理或術后病理檢查明確診斷為NSCLC；②均為首次診斷，既往未接受過抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他呼吸系統疾病，如肺炎、肺氣腫；②合并其他系統疾病或惡性腫瘤，如胃癌、乳腺癌；③合并免疫功能缺陷疾病。88例患者中男59例、女29例，年齡38～73(55.34±3.7)歲，≥55歲者40例、<55歲者48例，吸煙68例。癌組織病理檢測結果：中低分化55例，高分化33例；TNM分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期27例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例；有淋巴結轉移34例；腫瘤直徑≥3 cm 38例，<3 cm 50例。本研究通過重慶市第六人民醫院倫理委員會批準。

1.2 NSCLC組織及癌旁組織中LncRNA SNHG5與miR-26b表達檢測 應用TRIzol法提取新鮮(離體30 min以內)NSCLC及癌旁組織(距腫瘤邊緣﹥5 cm)中總RNA(試劑盒購自美國Invitrogen公司)，使用微量核酸蛋白檢測儀測RNA濃度，將符合標準的RNA凍存，備用。使用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將RNA反轉錄合成cDNA，反應條件：37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。反應體系：1 μL dNTP，1 μL逆轉錄酶，1.5 μL 10×RT緩沖液，0.2 μL RNase抑制劑，1 μL RNA，3 μL miRNA-155/U6 RT引物和8 μL H2O。qPCR反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃延伸10 s，共40個循環。反應體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA聚合酶，1 μL miRNA-155/U6 RT產物和8 μL H2O。SNHG5 正向引物：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′，反向引物：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；內參基因U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物:5′-GGCTGAGAACTGAATTCCA-3′。miR-26b 正向引物：5′-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUC-3′，反向引物：5′-GACUCCGGUGGAAUGAAGGAUU-3′；以GAPDH作為內參照，正向引物:5′-CGGATTTGGT-CGTATTGGG-3′，反向引物:5′-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。每個樣本至少重復3次試驗，最后采集熒光信號，結果以2-ΔΔCt計算和標準化LncRNA SNHG5與miR-26b的相對表達量。

1.3 隨訪 自患者出院起，每1～3個月隨訪1次，隨訪包括門診和電話兩種方式，隨訪時間3～60個月，隨訪至終止時間或患者死亡，隨訪時間截至2019年12月，收集患者生存數據。

2 結果

2.1 NSCLC組織與癌旁組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達比較 LncRNA SNHG5在NSCLC組織及癌旁組織中的相對表達量分別為1.63±0.62、1.95±0.52，NSCLC組織中LncRNA SNHG5的相對表達量低于癌旁組織(t=3.71，P<0.05)。miR-26b在NSCLC組織及癌旁組織中的相對表達量分別為0.76±0.14、1.60±0.45，NSCLC組織中miR-26b的相對表達量低于癌旁組織(t=16.72，P<0.05)。Spearman相關分析結果顯示，LncRNA SNHG5與miR-26b表達呈正相關(r=0.328，P<0.05)。

2.2 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達與患者臨床病理特征的關系 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b相對表達量與TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，見表1。

表1 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達與患者預后的關系 88例NSCLC患者均獲隨訪，無失訪病例。隨訪3年內，共有39例患者死亡。NSCLC癌組織中LncRNA SNHG5相對表達量以中位數1.56為臨界值，分為高表達組43例、低表達組45例，LncRNA SNHG5高表達組3年總體生存率(OS)65.1%(28/43)，LncRNA SNHG5低表達組3年OS為46.7%(21/45)。Kaplan-Meier分析(Log-rank檢驗)結果顯示，LncRNA SNHG5高表達組3年總體生存率高于LncRNA SNHG5低表達組(χ2=4.265，P=0.038)。

miR-26b相對表達量以中位數0.72為臨界值，分為高表達組42例和低表達組46例。miR-26b高表達組3年OS為71.4%(30/42)，miR-26b低表達組3年OS為41.3%(19/46)。Kaplan-Meier分析(Log-rank 檢驗)結果顯示，miR-26b高表達組3年總體生存率低于miR-26b低表達組(χ2=3.862，P=0.049)。

3 討論

NSCLC早期臨床表現不明顯，一旦出現呼吸困難、胸痛、咳血等臨床癥狀時已為晚期，患者預后較差[2]。淋巴結轉移是影響NSCLC預后的最重要因素之一。

LncRNA是一組非編碼RNA。近年來，LncRNA已被證實是細胞代謝過程中的調節劑[3]，如通過調節miRNA來促進mRNA 的轉錄及轉錄后翻譯，進而影響蛋白質表達。LncRNA SNHG5是LncRNA家族中的一員，其在前列腺癌、腎細胞癌及乳腺癌中均表達下調[10]，在乳腺癌的發生發展中通過調節NF-κB信號通路發揮抑癌或致癌作用。本研究結果顯示，NSCLC組織中LncRNA SNHG5表達低于癌旁組織，且差異有統計學意義。其機制可能是當LncRNA SNHG5表達下調時，細胞凋亡率下降，促進癌細胞的增殖及分化，腫瘤的惡性程度增加[11]。本研究發現，LncRNA SNHG5表達與NSCLC患者TNM分期、組織分化程度及淋巴結轉移有關。有文獻報道，LncRNA SNHG5通過調節上皮間充質轉化(EMT)來調節腫瘤的發生發展[11]。EMT是指上皮細胞惡變過程中逐漸失去上皮細胞的部分特征，如上皮屬性蛋白E-cadherin表達下調，使得細胞之間的黏附力降低、而運動能力逐漸增強，增強惡性變細胞的轉化過程。LncRNA SNHG5表達下調，對細胞EMT過程的抑制能力減弱，間接促進了腫瘤細胞的惡性進展。此外，LncRNA SNHG5還可通過抑制轉移相關蛋白2來促進細胞質中蛋白合成，加速細胞的生長周期，進而促進癌細胞的增殖分化及轉移過程[12]。LncRNA SNHG5還可靶向抑制miR-32/Kruppel樣因子4軸的活性，激活其調節上調靶基因的功能，SNHG5的降低間接加快腫瘤細胞的生長，加速腫瘤的惡性進展[13]。

miRNA是非編碼的單鏈RNA，占人類基因組序列的1%～3%，雖然數量較少，但卻具有較多生物學功能，如促進細胞增殖、胚胎發育等[14]。miR-26家族是一個高度保守的小分子非編碼RNA，主要表達于心肌細胞，且在腫瘤細胞增殖、分化及凋亡過程中發揮重要作用[14]。miR-26b是miR-26家族的成員之一，其染色體位置為2號染色體基因CTDSP1第4個內含子上，在肝癌、神經膠質瘤、胃癌中呈異常表達[15]。研究證實，乳腺癌組織中，miR-26b通過靶向調節下游靶基因(如CDK8、SLC7A11)來抑制癌細胞的生長及分化過程[15]。本研究結果顯示，NSCLC組織中miR-26b表達低于癌旁組織，且差異有統計學意義。研究發現，miR-26b具有抑癌基因的作用，其通過抑制NF-κB信號通路進而抑制腫瘤細胞增殖[16]。當NSCLC中miR-26b表達降低時，其抑制癌細胞生長的作用減弱，間接地對肺癌細胞的增殖及分化過程起到促進作用，增加癌細胞的惡性程度。本研究結果顯示，miR-26b表達與NSCLC患者TNM分期、組織分化程度及淋巴結轉移有關。研究發現，miR-26b可通過抑制細胞的增殖、誘導細胞凋亡及停滯細胞的生長周期來實現抑制癌組織的生長分化過程[16]。另外，miR-26b可靶向調節蛋白酶氨酸磷酸酶IVA1來抑制肺癌細胞的增殖及遷移過程，因此，當肺癌組織中miR-26b表達下調時，其抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡及遷移的作用減弱，對癌細胞的增殖及侵襲過程起到一定程度促進作用，miR-26b表達越低，癌組織的惡性程度越高。miR-26b可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，進而刺激下游靶基因ZNRD1的表達，對腫瘤細胞的生長起到積極促進作用，加速腫瘤細胞的增殖及分化過程，進一步增加腫瘤的惡性程度[17]。

本研究中LncRNA SNHG5和miR-26b的高表達組3年生存率均高于低表達組，說明LncRNA SNHG5和miR-26b低表達很可能與NSCLC患者的不良預后相關，并有可能成為NSCLC預后不良的腫瘤標志物。LncRNA SNHG5與miR-26b表達呈正相關，兩者在腫瘤發生發展過程中發揮協同作用，共同促進腫瘤細胞的增殖、分化過程，但二者在NSCLC中的具體作用機制還需進一步研究。

綜上所述，NSCLC組織中LncRNA SNHG5和miR-26b表達均降低，與腫瘤組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及患者預后相關；檢測二者表達有助于NSCLC病情判斷及預后評估。