野生型和自然缺失突變型HBx蛋白對肝癌細胞生物學行為的影響

張晶，畢利泉，辛萱，王翠翠，劉曉紅

1 山東省立第三醫(yī)院，濟南250031；2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院

乙型肝炎病毒(HBV)與肝癌的發(fā)生密切相關。HBV基因組具有四個開放讀碼框，其中X基因是最小的一個，其編碼的HBx蛋白在轉錄水平反式激活病毒基因表達，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織中存在頻發(fā)的HBx基因的缺失突變，導致HBx蛋白羧基端氨基酸的缺失，但其確切生物學功能和作用機制尚不清楚[2,3]。既往我們在人肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了HBx基因的自然缺失突變體，其編碼的HBx蛋白羧基端129-154aa缺失，我們命名為HBx-128w[4]。2012年3月—2015年12月，我們構建了含全長序列野生型HBx(HBx-FJ)和羧基端缺失129-154aa突變型HBx(HBx-128w)的真核表達載體，用pcDNA3.1空載體作為對照，通過轉染人肝癌細胞系SMMC-7721并檢測各轉染組細胞的生物學活性，了解該自然缺失突變體和野生型HBx蛋白對SMMC-7721細胞生物學行為的影響，從而明確這兩種蛋白在肝癌發(fā)生中的作用及功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系SMMC-7721(以下稱SMMC-7721細胞)購自中國科學院細胞庫。重組表達載體pcDNA3.1-HBx-128w和pcDNA3.1-HBx-FJ購自上海銳賽生物技術有限公司。真核表達載體pcDNA3.1和脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；鼠抗HBxAg單克隆抗體、辣根過氧化酶(HRP)標記的鼠抗兔IgG二抗、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒購自上海碧云天公司；G418培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco BRL公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Bio-Rad公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙啶、RNaseA購自美國Sigma公司；Transwell小室及Matrigel膠購自美國Corning公司；多聚甲醛、結晶紫均為國產分析級產品；SPF級5周齡雄性BALB/C裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司。NanoDrop ND-1000超微量分光光度計購自美國Nanodrop公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Synergy酶標儀購自美國Bio-Tek公司；流式細胞儀FACScan購自美國Becton Dicknson公司。

1.2 細胞轉染與穩(wěn)定轉染細胞株的篩選 SMMC-7721細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱，隔天換液1次，PBS洗滌2次，3～4 d傳代1次。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SMMC-7721細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2 min，用含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基吹打細胞形成單細胞懸液。以每孔6×105個接種于6孔板，隨機分為pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組，每組設3個復孔。將6孔板放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至細胞80%～90%融合時取出，去除原培養(yǎng)基，加入500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，備用。取10 μL LipofectamineTM2000試劑加入到240 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育5 min；4 μg待轉染質粒加入到240 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育5 min。將這兩種稀釋物混合形成質粒-LipofectamineTM2000混合物，室溫孵育20 min。將質粒-LipofectamineTM2000混合物平均分配至待轉染孔中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。去除含質粒-LipofectamineTM2000復合物的培養(yǎng)基，添加含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取1/3的細胞用PBS沖洗，胰蛋白酶消化后加入6孔板，并加入含G418(終濃度為600 μg/mL)的培養(yǎng)基，每3 d更換1次新的G418篩選培養(yǎng)基，10 d左右可見大部分細胞死亡，降低G418濃度至300 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)，每周更換1次新的篩選培養(yǎng)基，至培養(yǎng)皿中可見少量肉眼可見的克隆，將之用胰蛋白酶消化后擴大培養(yǎng)。

1.3 各組穩(wěn)轉細胞HBx蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取培養(yǎng)48 h的各組穩(wěn)轉細胞及未轉染SMMC-7721細胞，PBS清洗2次，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，冰上將細胞刮下，轉移至EP管中，100 ℃水浴10 min，12 000 g離心5 min(離心半徑10 cm)，取上清，上樣至10%的SDS-PAGE凝膠加樣孔內電泳(100 V)。濕轉法將蛋白質電泳產物轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次，加入鼠抗HBxAg單克隆抗體4 ℃過夜，β-actin作為內參。次日加入HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min，ECL化學發(fā)光檢測試劑盒顯影成像。

1.4 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期的各組穩(wěn)轉細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基吹打細胞，形成密度為5×104/mL的單細胞懸液。按1×104/孔接種于96孔板中，每組設3個復孔，取平均值。置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。接種后每24 h為1個檢測點，連續(xù)檢測7 d。檢測時每孔中避光加入5 mg/mL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后除去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，避光反應15 min。每孔各取100 μL轉移至新的酶標板，于酶標儀上讀取570 nm波長處的OD值，以時間為橫坐標、OD570值為縱坐標并繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用平板克隆形成實驗。取對數(shù)期生長的各組穩(wěn)轉細胞，0.25%胰蛋白酶消化，按3×102/孔細胞密度接種于6孔板，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，至出現(xiàn)肉眼可見的克隆，4%多聚甲醛固定15 min，0.4%結晶紫染液染色10 min，PBS沖洗、拍照并計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。每組設3個復孔，各組實驗均重復3次。

1.6 細胞周期測定 取對數(shù)生長期的各組穩(wěn)轉細胞，制成密度為1×106/mL的單細胞懸液，按2×106/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后終止培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，預冷的PBS清洗2次，1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，棄上清，加入70%乙醇4 ℃過夜固定。加入PBS離心，用200 μL的PBS重懸細胞，100 μg/mL RNaseA 37 ℃消化30 min。加入50 μg/mL溴化乙啶4 ℃避光染色30 min，流式細胞儀測定。每孔設3個復孔，實驗重復3次。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。取對數(shù)生長期的各組穩(wěn)轉細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液。按1×105/孔接種于6孔板中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待融合度達到90%時，棄去培養(yǎng)基，用200 μL Tip頭部垂直快速劃痕，PBS洗去劃下的細胞，記錄時間為0 h，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件測量劃痕區(qū)寬度，計算劃痕寬度百分比(%)=(48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。每組實驗重復 3 次。

1.8 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。無血清培養(yǎng)基以1∶8稀釋 Matrigel膠，平鋪于Transwell上室。取對數(shù)生長期的各組穩(wěn)轉細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，按1×104個(200 μL)加入到上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄掉下室的培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定15 min，0.4%結晶紫染液染色10 min，除去上室殘留的細胞，顯微鏡下隨機取5個不同的視野(×100)拍照并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。每組實驗重復3次，取均值。

1.9 各組穩(wěn)轉細胞體外成瘤能力檢測 采用裸鼠成瘤實驗。裸小鼠置于層流架中SPF條件下飼養(yǎng)，所用飼料、墊料、籠具及器械均高壓消毒后使用。將9只SPF級5周齡雄性BALB/C裸小鼠隨機分為3組，分別接種pcDNA3.1-HBx-FJ、pcDNA3.1-HBx-128w、pcDNA3.1轉染的SMMC-7721細胞。每只小鼠于頸背部皮下接種，接種后10 d左右腫瘤生長至可測量大小，之后每4～5 d測量腫瘤體積，接種后第32天無痛處死裸鼠，測量各移植瘤的重量。

2 結果

2.1 穩(wěn)轉細胞HBx蛋白表達 Western blotting結果顯示，HBx-FJ組和HBx-128w組SMMC-7721細胞檢測到HBx陽性條帶，而pcDNA3.1組無此條帶，提示HBx蛋白在HBx-FJ組和HBx-128w組SMMC-7721細胞內高表達。

2.2 各組SMMC-7721細胞增殖活性比較 MTT實驗結果顯示，從第2天開始，HBx-FJ組和HBx-128w組細胞增殖能力高于pcDNA3.1組(P<0.05)；從第4天開始，HBx-128w組細胞增殖能力高于HBx-FJ組(P<0.05)。見表1。

表1 轉染后各組SMMC-7721細胞增殖活性比較

2.3 各組SMMC-7721細胞增殖能力比較 pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組細胞的克隆形成率分別為40.11%±5.32%、52.67%±6.34%、70.78%±4.53%，HBx-FJ組和HBx-128w組細胞增殖能力高于pcDNA3.1組，而HBx-128w組細胞增殖能力高于HBx-FJ組(P均<0.05)。

2.4 各組SMMC-7721細胞周期比較 流式細胞分析結果顯示，與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組G1期細胞減少，S期細胞增多(P<0.05)；而HBx-FJ組和HBx-128w組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 轉染后各組SMMC-7721細胞周期分布

2.5 各組SMMC-7721細胞遷移能力比較 劃痕實驗結果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組細胞的劃痕寬度百分比分別為84.44%±6.74%、72.78%±4.19%、46.67%±12.02%。與pcDNA3.1組和HBx-FJ組相比，HBx-128w組細胞的遷移距離增加(P<0.05)；而pcDNA3.1組和HBx-FJ組細胞遷移能力比較無統(tǒng)計學差異。

2.6 各組SMMC-7721細胞侵襲能力比較 Transwell實驗結果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組穿膜細胞數(shù)分別為(35.2±6.14)、(63.2±7.50)、(93.0±7.18)個。與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組的穿膜細胞數(shù)增加(P均<0.05)；與HBx-FJ組相比，HBx-128w組穿膜細胞數(shù)增加(P<0.05)。

2.7 各組SMMC-7721細胞體外成瘤能力比較 移植瘤體積測量結果顯示，HBx-128w組移植瘤體積大于HBx-FJ組和pcDNA3.1組(P均<0.05)；而HBx-FJ組移植瘤體積雖大于pcDNA3.1組，但差異無統(tǒng)計學意義，見表3。移植瘤重量測量結果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組移植瘤重量分別為(90.435±49.526)、(190.092±51.631)、(255.995±31.658)mg；與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組移植瘤重量增加(P均<0.05)；而HBx-128w組移植瘤重量雖大于HBx-FJ組，但差異無統(tǒng)計學意義。

表3 轉染后各組移植瘤體積比較

3 討論

2018年2月，中國國家癌癥中心發(fā)布最新癌癥數(shù)據(jù)，肝癌是中國第四位的常見惡性腫瘤和第二位的腫瘤致死原因，全世界新發(fā)肝癌病例約50%來自我國，而我國的肝癌患者多與HBV慢性感染有關，往往具有肝纖維化、肝硬化背景[5,6]。目前， HBV基因組的整合與突變被認為可促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[7～9]。HBV基因組是一種部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子，雙鏈長度不等，其長鏈含有4個公認的開放讀碼框——S、C、P、X[10]，其中X基因是較易被整合的基因，頻繁整合于宿主基因組，導致染色體的不穩(wěn)定和突變的發(fā)生，是HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]，其編碼基因區(qū)位于1374～1838核苷酸，整合后的X基因編碼HBx蛋白，相對分子質量約17 kD，有145～154個氨基酸殘基，是具有廣泛激活作用的反式作用因子[12]。其反式激活功能與抗細胞增殖、促細胞凋亡、抑制細胞轉化密切相關，此有利于HBV在宿主體內的感染與復制。由于HBx蛋白不能直接與DNA雙鏈結合，而是通過蛋白質—蛋白質的相互作用，結合細胞核內的轉錄因子或影響細胞漿內的信號轉導途徑，直接或間接地作用于靶基因的啟動子或增強子，實現(xiàn)其反式激活功能[13]。

既往研究表明，在HCC組織中存在頻繁的HBx基因3′端缺失突變，導致HBx蛋白羧基端氨基酸不同數(shù)目的缺失。對這些缺失突變體功能研究顯示,氨基酸缺失的數(shù)目和位置不同，對HBx蛋白活性的影響也不同。Ritter等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白C末端第149～154aa或N末端第2～30aa缺失不影響HBx的活性；而C末端的106～154aa或N末端1～9aa缺失，HBx的活性完全喪失；N末端3～66aa缺失，HBx的活性明顯下降。因此認為，HBx蛋白的3～66aa和106～148aa是其功能域。Arii等[15]認為，HBx蛋白的3個區(qū)域(46～52aa、61～69aa、132～139aa)是其反式激活功能所必需的。Yoo等[16]認為，HBx蛋白的氨基端缺失對其反式激活功能影響不大，而羧基端缺失會使其嚴重喪失反式激活功能。HBx的缺失突變讓野生型HBx促細胞凋亡的能力消失，其反式激活功能受到抑制，其功能區(qū)域在調節(jié)細胞增殖、凋亡、轉化間的平衡改變，導致肝細胞單克隆性無控生長。

我們發(fā)現(xiàn)的HBx自然缺失突變體缺失了羧基端129～154aa，正好包含了132～139aa區(qū)域，與功能域106～148aa一致。體外實驗結果顯示，自然缺失突變體HBx-128w能顯著增強肝癌細胞SMMC-7721的增殖能力、克隆形成能力、遷移侵襲能力及體外成瘤能力，細胞周期檢測結果顯示，HBx-128w促進細胞由G1期到S期的進程。Zhang等[17]亦從人HCC組織中發(fā)現(xiàn)了HBx的自然缺失突變體，其羧基端氨基酸128～154aa缺失。他們的實驗結果顯示，突變型HBx蛋白能增強細胞增殖，與本研究結果一致；他們還發(fā)現(xiàn)，突變型HBx蛋白失去了誘導細胞凋亡的能力，這可能是HBx缺失突變體促進HCC發(fā)生的原因之一。Ma等[18]研究了羧基端缺失121～154aa的HBx蛋白功能，認為該節(jié)段HBx蛋白通過激活細胞增殖在HCC癌變中發(fā)揮重要作用，并且比野生型HBx更能有效轉化正常肝細胞系MIHA。這與我們的研究結果一致。本實驗結果還顯示，野生型HBx亦能增強SMMC-7721細胞的增殖活性、增殖能力、侵襲能力及體外成瘤能力，同樣能促進細胞由G1期到S期的進程，但是缺失突變體HBx-128w的作用較之更顯著。提示野生型HBx蛋白的持續(xù)高表達可能通過加速肝細胞凋亡從而誘導肝細胞再生以及基因突變的積累，最終導致肝細胞的惡性轉化[19]。此外，HBx蛋白的持續(xù)高表達可以激活宿主體內多種轉錄因子和信號轉導通路，參與HCC的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，人HCC組織內普遍存在異質性的HBx，即可同時檢測到野生型和突變型HBx[3]。因此，不排除二者協(xié)同作用，共同促進HCC的發(fā)生。

綜上所述，野生型HBx蛋白和缺失突變體HBx-128w均能促進肝癌細胞SMMC-7721的惡性轉化，在HCC發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。HBx蛋白的羧基端129～154aa區(qū)域是其重要功能區(qū)域，該區(qū)域的缺失使缺失突變型HBx蛋白發(fā)揮不同于野生型HBx蛋白的生物學功能，二者可能在HCC的不同發(fā)展階段發(fā)揮作用，共同促進HCC的發(fā)生發(fā)展。未來我們將借助芯片技術研究二者在調控的靶基因及LncRNA方面的差異，進一步篩選差異表達基因，尋找治療HCC的合適靶點。