慢性丙肝患者外周血單核細胞中TLR2、CTLA-4 mRNA的表達及意義

朱建光，沈露，周漢義，鄭曦，劉啟勝

咸寧市中心醫院(湖北科技學院附屬第一醫院)，湖北咸寧437100

慢性丙型肝炎(CHC)是一種因感染丙型肝炎病毒而導致的慢性肝臟疾病，臨床主要表現為食欲不振、黃疸癥狀。CHC患者中約50%處于慢性持續感染狀態，后期可并發肝硬化、肝性腦病、肝癌等，對患者的健康造成嚴重影響[1]。因此，定期復查，全面了解和評估肝功能和肝纖維化程度對延緩疾病進展至關重要，目前臨床主要應用肝穿刺活檢評估肝纖維化程度，但由于肝穿刺活檢為有創操作，易并發出血，臨床應用受限[2]。所以，尋找一種無創而高效的方法評價肝纖維化程度成為亟待解決的難題。細胞毒性T細胞相關抗原4(CTLA-4)是表達于T細胞的自分泌因子，可通過調節T細胞分泌免疫相關因子，參與CHC進程。Toll樣受體2(TLR2)是丙型肝炎病毒的主要致病通路。目前關于TLR2及CTLA-4與肝纖維化的關系鮮見報道[3，4]。2017年1月—2019年12月，我們檢測了CHC患者外周血單核細胞中TLR2及CTLA-4 mRNA的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月—2019年12月于我院就診的CHC患者100例(CHC組)。納入標準：①符合CHC的診斷標準[5]；②住院時間大于1周；③患者或其家屬簽署知情同意書。排除標準：①合并腎、心血管、泌尿等其他系統嚴重疾病者；②同時合并甲肝、乙肝病毒感染者；③近期有感染或血液系統疾病者。男68例、女32例，年齡(63.58±2.58)歲，BMI(23.19±1.28)kg/m2。隨機選擇同期體檢健康者100例作為對照組，男70例、女30例，年齡(64.14±1.46)歲，BMI(23.56±1.65)kg/m2。兩組性別、年齡、BMI差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究經我院倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 肝纖維化的診斷和分期 于B超引導下選擇右腋前線第7、8、9肋間作為穿刺區域，穿刺時注意避開心臟和大血管，取組織活檢，并分別由2名以上病理科專業人員對組織圖片進行判讀，根據肝纖維化程度分為5期，F4期：早期肝硬化；F3期：大量纖維間隔形成，肝小葉結構紊亂但無肝硬化；F2期：纖維化擴大至匯管區周圍并形成纖維間隔，肝小葉結構仍保留；F1期：竇周及小葉內纖維化，局限性匯管區纖維化擴大；F0期：無明顯纖維化[6]。本研究F0期15例，F1期19例，F2期39例，F3期21例，F4期6例。

1.3 實驗室相關指標檢測 CHC組于入院當天(對照組于體檢日)抽取空腹外周靜脈血10 mL，3 000 r/min離心6 min(離心半徑10 cm)，靜置取上清，用全自動生化分析儀(山東博科生物產業有限公司，BK-200)和血液分析儀(廣州市樂邦醫療器械有限公司，SK5002)檢測血清血小板(PLT)、甲胎蛋白(AFP)、AST、ALT、谷氨酰基轉移酶(GGT)、TC和總膽紅素(TBil)，并根據PLT、ALT、GGT、CHOL、AST值計算基于4因子的纖維化指數(FIB-4指數)、天門冬氨酸氨基轉移酶-血小板比值指數(APRI)、Forns 指數[7]。FIB-4 指數=年齡(歲)×AST(U/L)/血小板計數(×109/L)×ALT1/2(U/L)；APRI=AST(U/L)÷PLT(×109/L)；Forns指數=7.811-3.131×ln(PLT[×109/L])+0.781×ln(GGT[IU/L])+3.467×ln年齡-0.014×CHOL[mmol/L]。

1.4 CHC患者外周血單核細胞中TLR2 mRNA及CTLA-4 mRNA表達檢測 用Ficoll密度離心法分離外周血單核細胞，提取細胞中的RNA，并用紫外分光光度計(深圳市科力易翔儀器設備有限公司，UV3200S)測量RNA的量，再利用逆轉錄酶合成cDNA，用RT-PCR(儀器及試劑盒由深圳市康初源有限公司提供，貨號：210212)檢測TLR2 mRNA(正向引物序列：5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′，反向引物序列:5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′)及CTLA-4 mRNA(正向引物序列：5′-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3′，反向引物序列：5′-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3′)的表達量。RT-PCR擴增循環設置參數：預變性(94 ℃, 1 min)后，進行45個循環擴展梯度(94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min)，末次延伸(72 ℃,10 min)。以空白對照進行基線調整，以β-actin作為內參基因，采用2-△△CT方法計算目的mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 兩組實驗室指標比較 CHC組AST、AFP、ALT、GGT、TBil、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指數、APRI、Forns 指數高于對照組，PLT、TLR2 mRNA低于對照組(P均<0.05)，見表1。

表1 兩組實驗室指標結果

2.2 不同肝纖維化程度者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達比較 隨著肝纖維化程度增加，CTLA-4 mRNA表達升高、TLR2 mRNA表達降低，組間差異有統計學意義(P均<0.05)，見表2。

表2 CHC組不同纖維化分級患者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達比較

2.3 CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA與肝纖維化的相關性 相關性分析結果顯示，AST、AFP、ALT、FIB-4 指數、APRI、Forns 指數與CTLA-4 mRNA表達呈正相關(r分別為0.427、0.547、0.351、0.572、0.472、0.569，P均<0.05)，與TLR2 mRNA表達呈負相關(r分別為-0.471、-0.427、-0.317、-0.488、-0.533、-0.468，P均<0.05)；PLT與CTLA-4 mRNA表達呈負相關(r=-0.427，P<0.05)，與TLR2 mRNA表達呈正相關(r=0.571，P<0.05)，總膽紅素與CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達無關(r分別為0.132、0.174，P均>0.05)。

2.4 發生明顯肝纖維化(F2～F4)與無或輕度肝纖維化(F0+F1)患者臨床指標比較 無或輕度肝纖維化的AST、PLT、AFP、ALT、FIB-4 指數、APRI、Forns 指數、GGT、CTLA-4 mRNA小于明顯肝纖維化，TLR2 mRNA大于明顯肝纖維化(P均<0.05)，兩者總膽紅素比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 明顯肝纖維化與無或輕度肝纖維化患者臨床指標結果

2.5 血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA水平預測明顯肝纖維化的診斷效能 CTLA-4 mRNA診斷明顯肝纖維化的臨界值為1.35，靈敏度為0.836，特異度為0.894，ROC曲線下面積為0.889(95%CI:0.834～0.944)，TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的臨界值為1.10，靈敏度為0.816，特異度為0.885，ROC曲線下面積為0.868(95%CI:0.803～0.933)。見圖1、圖2。

圖1 CTLA-4 mRNA診斷明顯肝纖維化的ROC曲線

圖2 TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的ROC曲線

3 討論

CHC是一種慢性肝臟炎性疾病，由急性丙型肝炎病毒感染轉化而來，易進展為肝硬化、肝癌，其中肝纖維化在CHC疾病進展中發揮重要作用[8]。肝纖維化是肝臟疾病進展為肝硬化的階段之一，早期肝纖維化為一種可逆過程。因此，早期對肝纖維化程度進行評判對控制甚至逆轉患者病情有重要作用。肝穿刺活檢為判斷肝纖維化的金標準，但由于存在風險和費用高昂等原因難以在臨床上推廣，而目前臨床上使用的無創性檢查包括影像學檢查和APRI等的準確性有待提高[9]。基因與肝纖維化的相關研究成為研究熱點。研究表明，相關基因可通過表達一系列細胞因子，參與CHC疾病的發生發展[10]。

研究表明，丙型肝炎所致肝硬化是由于丙型肝炎病毒感染后，機體免疫紊亂而導致的疾病，丙型肝炎病毒可通過刺激機體產生體液免疫和細胞免疫，破壞CD3、CD4細胞，使相關細胞不能發揮免疫殺傷和免疫調節作用，從而不能有效發揮清除病毒，使病情遷延不愈[11，12]。CTLA-4、TLR2被認為是免疫相關細胞表面蛋白，主要由調節性T淋巴細胞合成。CTLA-4是免疫球蛋白超基因家族成員，與B7具有較高的親和力(CD28的10倍)，對T細胞增殖及免疫反應均有負向調節作用。正常情況下，外來免疫原激活機體免疫時促使CD28與B7結合，促進T細胞的增殖活化，發揮免疫作用清除異物。而CHC患者體內CTLA-4表達顯著升高，CTLA-4競爭性與CD229同B7結合，形成免疫抑制復合物，阻礙CD28信號通路傳導，下調T細胞的活性，減緩T細胞的活化與增殖，從而使機體對丙肝抗原的清除作用減弱，使病情加重[3]。TLR2是一種重要的膜蛋白識別受體，具有抗原識別作用，當丙型肝炎病毒侵入機體時被激活，使NF-κB等通路活化，進一步激活下游的炎性因子和細胞因子，參與對病毒的清除作用[11]。本研究結果顯示，CHC患者體內CTLA-4 mRNA表達升高，而TLR2 mRNA表達降低。進一步對肝纖維化亞組分析，隨著肝纖維化程度的加重，CTLA-4 mRNA逐漸增加，TLR2 mRNA逐漸減小。表明CHC患者肝纖維化受累程度越重，體內CTLA-4蛋白表達增加而TLR2蛋白減少，免疫抑制程度加深。胡安印等[12]研究發現，CTLA-4是多種免疫性疾病的介導因子，在類風濕、自身免疫性肝病等多種疾病中發揮作用。楊景毅等[13]研究發現，TLR2可通過MAPK/ERK通路抑制乙肝病毒的復制，促進機體對病毒的清除作用，延緩慢性乙肝以及肝硬化的進程，臨床不僅可通過檢測TLR2水平評估肝硬化的程度，也為肝癌的治療提供了突破口。

進一步研究發現，CHC組AST、AFP、ALT、GGT、總膽紅素、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指數、APRI、Forns 指數高于對照組，PLT、TLR2 mRNA低于對照組。CHC患者肝細胞嚴重破壞，對膽紅素的處理能力降低，肝細胞內的酶如AST、ALT、GGT釋放入血，可通過檢測血液中肝細胞內酶的含量來評價肝功能，同時肝臟是造血器官，慢性肝炎時PLT的含量明顯降低。FIB-4指數、APRI、Forns 指數是通過計算患者年齡、AST、ALT、GGT等得到的，是目前臨床上較常使用的肝纖維化評價指標。沈偉等[14]研究發現，APRI對肝纖維化的特異度較高，肝纖維化與FIB-4指數、APRI、Forns 指數等呈正相關。本研究結果顯示，CTLA-4 mRNA表達與FIB-4 指數、APRI、Forns 指數呈正相關，TLR2 mRNA表達與FIB-4 指數、APRI、Forns 指數呈負相關，證實可通過檢測CTLA-4、TLR2 mRNA 表達來判斷肝纖維化程度。通過分析發現，CTLA-4、TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的敏感度和特異度均大于0.7，ROC曲線下面積分別為0.889、0.868。提示應用CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA預測肝纖維化有一定臨床價值。

綜上所述，外周血單核細胞中CTLA-4、TLR2 mRNA表達與CHC患者肝纖維化程度有關。臨床可通過檢測CTLA-4、TLR2 mRNA來預測肝纖維化情況，并指導臨床治療。