瘦素通過JAK/STAT途徑對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖和炎性反應的影響

李 浩 李曉淼 沈 奕 王偉力

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種常見的慢性關節炎[1]。其臨床病理特征包括關節軟骨進行性喪失，完整性破壞，關節摩擦增加等[2]。目前OA的發病機制尚不清楚，且無法確定治療方法[3]。白介素-1β(IL-1β)是OA發病機制的關鍵促炎細胞因子，可誘導各種分解代謝因子的表達，如誘導刺激軟骨細胞，使IL-6、IL-8和TNF-α表達升高，使炎性反應加重[4,5]。目前 IL-1β 作為體外研究中 OA 的誘導劑已被廣泛地使用[6]。

瘦素(Leptin)調節骨生長的作用最早于ob/ob小鼠生長發育過程中發現[7]。除作用于下丘腦等中樞神經系統外，瘦素還可通過外周方式作用于骨組織。瘦素受體在骨組織的表達水平及部位可直接反映其功能[8]。通過Janus激酶(Janus kinase, JAK)轉錄子的單轉導體和活化體(signal transducer and activator of transcription, STAT)轉導途徑影響腫瘤的生長和轉移[9]。因此，筆者試圖研究瘦素是否通過JAK/STAT途經對軟骨細胞增殖、凋亡和炎性反應有作用并探討其作用機制，為臨床治療OA提供新的理論依據。

材料與方法

1.材料:SD大鼠(上海交通大學醫學院動物實驗中心)；IL-1β、瘦素(美國Sigma公司)；DMEM/F12培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；甲苯胺藍染色試劑盒(上海如吉生物科技發展有限公司)；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒和Ⅱ型膠原抗體(美國Abcam公司)；IL-6、IL-8、TNF-α試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；p-JAK抗體、JAK抗體、p-STAT3抗體、STAT3抗體和二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

2.大鼠關節軟骨細胞的分離與培養:大鼠經乙醚麻醉后，用75%乙醇浸泡。置超凈工作臺分離出膝關節軟骨并切成薄片(1mm×1mm×1mm)，PBS沖洗3次。0.25%胰蛋白酶消化軟骨薄片30min，收集細胞懸液于離心管中，1000r/min離心5min，棄上清。將細胞在含5%胎牛血清的0.1% Ⅱ膠原酶37℃消化6h，1000r/min離心5min，棄上清。細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸，并按5×104個/毫升接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2的培養箱，2天更換一次培養基。按1∶3的比例傳代，第3代軟骨細胞可用于后續的實驗研究。

3.甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞染色對軟骨細胞的鑒定:甲苯胺藍染色：原代軟骨細胞接種到放有無菌且無劃痕玻片的6孔板(2×105個/毫升)中，培養48h后，將玻片夾出，用PBS漂洗2次。將細胞用甲醛固定2h后，用70%乙醇固定20min。1%甲苯胺藍染色30min。梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，記錄染色結果并在光學顯微鏡下分析。Ⅱ型膠原表達：原代軟骨細胞接種、培養、漂洗方法同上。細胞用10%多聚甲醛固定40min并用0.1%TritonX-100滲透后，用3%H2O2處理10min，5%封閉緩沖液室溫封閉30min。一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS洗滌3次。二抗(1∶100)室溫孵育30 min。待DAB顯色，蘇木精復染。脫水，封片后記錄染色結果并在光學顯微鏡下分析。

4.CCK-8檢測瘦素毒性和篩選最佳瘦素作用濃度：(1)瘦素毒性檢測：軟骨細胞以3×103個細胞接種到96孔板中，每孔100μl。細胞分為0ng/ml瘦素組[瘦素(0)組]、5ng/ml瘦素組[瘦素(5)組]、10ng/ml瘦素組[瘦素(10)組]、20ng/ml瘦素組[瘦素(20)組]、40ng/ml瘦素組[瘦素(40)組]和80ng/ml瘦素組[瘦素(80)組]，每組3個復孔。置37℃、5%CO2條件下孵育24h。將10μl CCK-8試劑加入每孔。2h后使用酶標儀在450nm處測量每孔細胞的吸光度(A)，計算細胞活力。(2)瘦素濃度篩選：軟骨細胞以3×103個細胞接種到96孔板中，每孔100μl。細胞分為對照組(不做任何處理)、IL-1β組(10ng/ml)、IL-1β+瘦素處理組(瘦素質量濃度為5、10、20、40和80ng/ml)，每組3個復孔。用藥組相應劑量的瘦素預處理1h，加入IL-1β，置37℃、5%CO2條件下孵育24h。將10μl CCK-8試劑加入每孔。2h后使用酶標儀在450nm處測量吸光度(A)，計算細胞活力。

5.集落形成實驗檢測軟骨細胞的增殖能力:軟骨細胞按1×105個/孔接種在6孔板中，按材料與方法中關于大鼠關節軟骨細胞的分離與培養方法進行處理，并置于37℃、5%CO2的培養箱中孵育。實驗結束后收集各組細胞并接種到60mm的培養皿中。3天更換1次培養基。14天后，用0.5%結晶紫染色，并計數含有≥50個細胞的集落，并進行拍照。

6.ELISA檢測軟骨細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量：實驗結束后收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書進行操作，450nm測定各孔的吸光度(A)，根據A值所繪制的標準曲線查出上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平。

7.Western blot法檢測JAK/STAT信號通路相關蛋白的表達：實驗結束后，棄去細胞上清液，PBS沖洗2次。加入1ml制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS溶液封閉1h，加入稀釋后的一抗，4℃搖床過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入對應于一抗種屬來源的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。使用ECL化學發光液顯色發光，凝膠成像系統拍照，Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行灰度值分析。

結 果

1.軟骨細胞鑒定:軟骨細胞的形態呈長紡錘形，而細胞膜光滑且折射良好(圖1A)。甲苯胺藍染色顯示深藍色的細胞核，藍紫色的細胞核，紫紅色的軟骨細胞質(圖1B)。此外，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果顯示(圖1C)，細胞質呈褐色，細胞核被染成藍色，由于Ⅱ型膠原是由軟骨細胞特異合成和分泌的，因此成功分離和培養了原代軟骨細胞。

圖1 軟骨細胞的鑒定(×200)A.顯微鏡檢查軟骨細胞的細胞形態；B.大鼠原代軟骨細胞的甲苯胺藍染色；C.大鼠原代軟骨細胞的Ⅱ型膠原免疫細胞染色

2.瘦素最佳濃度的篩選:CCK-8結果表明，單獨用不同濃度的瘦素(0、5、10、20、40、80ng/ml)培養軟骨細胞24h時，軟骨細胞的細胞活力不受瘦素處理的影響(圖2A)。IL-1β刺激顯著抑制了軟骨細胞的細胞活力，瘦素+IL-1β處理軟骨細胞可削弱IL-1β對軟骨細胞活力的抑制，其中當瘦素濃度為10、20、40ng/ml時，軟骨細胞活力增加更明顯(圖2B,P<0.05)，因此，后續實驗瘦素濃度選擇10、20、40ng/ml。

圖2 最佳瘦素濃度的篩選A.CCK-8分析檢測瘦素(0、5、10、20、40、80ng/ml)處理軟骨細胞24h時的細胞活力；B.CCK-8分析檢測IL-1β刺激軟骨細胞后，不同濃度的瘦素對軟骨細胞活力的影響。與對照組比較，*P=0.000；與瘦素(0)組比較，#P<0.05,##P<0.01

3.瘦素促進IL-1β刺激誘導的軟骨細胞增殖：集落形成實驗結果表明，與對照組比較，IL-1β刺激誘導的軟骨細胞的增殖能力顯著下降(P=0.000)，不同濃度的瘦素使IL-1β刺激誘導的軟骨細胞的增殖能力增強(P<0.05，圖3)。

圖3 瘦素促進IL-1β刺激誘導的軟骨細胞增殖與對照組比較，*P=0.000；與瘦素(0)組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

4.瘦素抑制IL-1β刺激誘導的軟骨細胞炎性細胞因子的產生：ELISA結果表明，與對照組比較，IL-1β刺激誘導的軟骨細胞組的細胞培養上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的產生增加(P=0.000)，然而瘦素以劑量依賴性方式抑制IL-1β刺激誘導的炎性細胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的上調(P均<0.05，圖4)。

圖4 瘦素抑制IL-1β刺激誘導的軟骨細胞炎性細胞因子的產生A.各組細胞中IL-6的表達變化；B.各組細胞中IL-8的表達變化；C.各組細胞中TNF-α的表達變化。與對照組比較，*P=0.000；與瘦素(0)組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

5.瘦素抑制軟骨細胞中JAK/STAT信號通路的激活：Western blot法結果表明，與對照組比較，IL-1β顯著增強JAK/STAT信號轉導，使JAK和STAT3的磷酸化表達顯著增強(P<0.01)，不同濃度的瘦素以劑量依賴性方式逆轉IL-1β誘導的JAK/STA信號轉導，使JAK和STAT3的磷酸化表達降低(P<0.05,圖5)。

圖5 瘦素抑制軟骨細胞中JAK/STAT信號通路的激活與對照組比較，*P=0.000；與瘦素(0)組比較，#P<0.05、##P<0.01，###P=0.000

討 論

OA是導致殘疾的主要原因之一，嚴重影響著全世界約2.5億的患者[10～12]。由于OA的保守藥物治療不能緩解或阻止OA的發展，而且在進行手術的情況下需考慮風險和經濟負擔[13]。因此，迫切需要尋找可以延緩或逆轉OA發展的新的潛在OA藥物。

研究發現，IL-1β刺激導致軟骨細胞中炎性細胞因子的產生，也可以激活JAK/STAT信號通路并抑制軟骨細胞增殖[14,15]。本研究發現，IL-1β刺激誘導的原代軟骨細胞上清中IL-6、IL-8、TNF-α的表達量升高；IL-1β顯著增強JAK/STAT信號轉導，使JAK和STAT3的磷酸化表達顯著增強，進而使軟骨細胞的增殖能力顯著下降，凋亡能力顯著提高，與上述文獻報道一致。瘦素通過免疫細胞產生的細胞因子影響骨轉換，本研究發現瘦素能減輕IL-1β誘導刺激的軟骨細胞上清中炎性因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的表達，促進軟骨細胞的增殖能力，抑制JAK/STAT信號轉導，使JAK和STAT3的磷酸化表達下降[16]。

綜上所述，瘦素通過OA中的JAK/STAT信號途徑抑制炎性反應，增強了軟骨細胞的增殖，抑制其凋亡。因此，瘦素在OA的發病過程中起著至關重要的作用，為臨床上治療OA提供新的科學理論依據。