靈桿菌胞外核酸酶在短短芽孢桿菌中的高效表達(dá)

龔雪梅 ， 胡艷紅 ， 陳銀霜 ， 程睿婕 ， 張坤曉 *

（1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 連云港 222005；2. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005；3. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

核酸污染是重組蛋白類生物藥物制備過(guò)程中存在的一個(gè)重大問(wèn)題，殘留的核酸同藥物一起注入患者體內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)估的后果，存在導(dǎo)致人體基因組DNA 突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)。 因此，核酸殘留量是重組蛋白藥物質(zhì)量的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]，如何去除重組蛋白藥物中殘留的宿主核酸是提高該類藥物安全性的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。 目前常用的核酸去除方法有物理法、層析法以及核酸酶法，前兩種方法所需的儀器設(shè)備昂貴， 且不適用于大規(guī)模去除核酸；利用核酸酶的高效性來(lái)降解核酸是除去蛋白質(zhì)中宿主核酸殘留的最理想方法[2]。 目前市場(chǎng)上商品化的非特異性核酸酶主要是Benzonase，由德國(guó)默克公司開(kāi)發(fā)，純度高、活性好，但因其重組表達(dá)難度大、價(jià)格昂貴，限制了其在生物制藥行業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。 基于目前的市場(chǎng)需求，開(kāi)發(fā)新的非特異性核酸酶生產(chǎn)工藝具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Benzonase 核酸酶是一種來(lái)自靈桿菌的非特異性核酸內(nèi)切酶（Serratia marcescens non-specificnuclease，SMNE），含有245 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約30 000，由兩條相同的單肽鏈組成同源二聚體[3-5]。 SMNE 能在較為寬泛的溫度（35~44 ℃）和pH 范圍（pH 6~10）內(nèi)降解所有形式（包括單鏈、雙鏈、線性、環(huán)狀和超螺旋）的DNA 和RNA，將核酸完全消化成2~5 bp堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸[6-7]，具有很高的降解效率。 有研究表明，其降解效率是金黃色葡萄球菌核酸酶的4 倍，是商品化 DNase I 的 34 倍[8]。 SMNE 能有效去除蛋白質(zhì)樣品中的核酸污染，還可降低蛋白質(zhì)樣品粘度、減少處理時(shí)間、增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，這些性質(zhì)使其成為生物制藥過(guò)程中的最佳選擇。

由于SMNE 能高效降解核酸，在體內(nèi)大量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致宿主死亡，對(duì)其重組表達(dá)及制備帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。默克公司最早利用大腸桿菌W3110 菌株對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)，通過(guò)分泌到大腸桿菌的周質(zhì)腔中成功獲得重組蛋白質(zhì)， 然而大腸桿菌分泌能力有限，最終產(chǎn)量?jī)H104U/L[9]。 其后有研究者利用大腸桿菌LK111（λ）菌株，通過(guò)形成包涵體的方式對(duì)SMNE 進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，其后通過(guò)繁瑣耗時(shí)的復(fù)性純化方式得到10 mg/500 mL 的產(chǎn)量[10]。 國(guó)內(nèi)的研究人員為了解決這一問(wèn)題嘗試了多種方法。 張開(kāi)俊課題組通過(guò)構(gòu)建分泌型載體 pET-20b（+），于 BL21（DE3） pLyss中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量為8 mg/L[11]。 2011 年，陳鵬課題組將 SMNE 與融合在載體pMAL-c4X 上的MBP 共表達(dá)， 其在胞內(nèi)的可溶性表達(dá)量為10 mg/L[12]。由此看來(lái)，利用大腸桿菌表達(dá)體系對(duì)SMNE 進(jìn)行重組表達(dá)始終存在著產(chǎn)量不足的問(wèn)題，尋找更適合SMNE 的表達(dá)系統(tǒng)， 提高其產(chǎn)量是促進(jìn)SMNE 工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

短短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力， 且胞外蛋白酶活性低，是用于分泌蛋白質(zhì)表達(dá)的理想宿主。 該表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著高于其他芽孢表達(dá)系統(tǒng)，在最佳的培養(yǎng)條件下短短芽孢桿菌的產(chǎn)量可以達(dá)到30 g/L[13]。 此外，該體系有一系列分子伴侶能夠促進(jìn)外源蛋白質(zhì)在分泌過(guò)程中形成具有活性的構(gòu)象[14]。 目前已成功表達(dá)出干擾素[15]、表皮生長(zhǎng)因子[16]、抗體[17-18]、淀粉酶[19]等多種醫(yī)療及工業(yè)用酶。然而，利用該系統(tǒng)表達(dá)毒性蛋白的相關(guān)報(bào)道較少。 本研究首次嘗試采用短短芽孢桿菌 HPD31-SP3 進(jìn)行SMNE 高效重組表達(dá)，利用自身細(xì)胞壁蛋白質(zhì)相關(guān)表達(dá)元件，構(gòu)建分泌型表達(dá)穿梭載體， 優(yōu)化發(fā)酵條件， 實(shí)現(xiàn)了SMNE在芽孢桿菌中高效可溶性重組表達(dá) （bSMNE）。 同時(shí)，SMNE 在短短芽孢桿菌中的成功表達(dá)，也為其他核酸酶在該系統(tǒng)的表達(dá)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌（E.coil JM109）：購(gòu)自Invitrovgen 公 司 ； 短 短 芽 孢 桿 菌 （Brevibacillus choshinensis HD31-SP3）：購(gòu)自 TaKaRa 公司。 重組質(zhì)粒pET28b-SMNE： 作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，SMNE的GenBank 序列登錄號(hào)為WP_101426767.1； 芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pNC-HisT： 購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶（XbaI、HindIII 等）、PCR Mix（Taq、Fast Taq 等）、無(wú)縫克隆試劑盒Hi-Fusion Mix 以及抗生素（氨芐青霉素、硫酸新霉素等）：購(gòu)自莫納生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒： 購(gòu)自O(shè)mega公司；鮭魚(yú)精DNA：購(gòu)自Amersco 公司；色譜層析基質(zhì)：購(gòu)自Toyopearl 公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；其他試劑：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司或進(jìn)口；凝膠成像儀：購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：Synergy Neo2 Muti-mode reader： 購(gòu)自 Bio-Tek 公司； 高速冷凍離心機(jī)： 購(gòu)自 J-26S XP （BECKMAN COULTER）公司；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)搖床：購(gòu)自Innova 44R（Eppendorf）公司；高壓破碎儀：購(gòu)自廣州聚能生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 T2 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10，蛋白胨 10，牛肉浸膏 5，酵母膏 2；LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母膏 5，氯化鈉 10。 T2G 培養(yǎng)基在 T2 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入體積分?jǐn)?shù)5%甘油。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒 pNC-HisT-SMNE 的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒 pNC-HisT 為載體， 使用 XbaI 和 HindIII 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收備用。 根據(jù)無(wú)縫克隆原理設(shè)計(jì)并合成引物 1：5′-GGATCCGTCGATCTAGA CATGGACACGCTCGAATCC-3′和引物 2：3′-CTAT AATGCCGAAGCTTTTAGTTTTTGCAGCCCATGAG -5′，以 pET28b-SMNE 質(zhì)粒為模板，用引物 1 和引物2 擴(kuò)增出SMNE 編碼基因片段，PCR 產(chǎn)物回收后，使用Hi-Fusion 無(wú)縫克隆試劑盒， 將SMNE 基因片段與線性化的pNC-HisT 載體進(jìn)行連接， 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 JM109。 使用引物 3：5′-GCAACTTTTGATTCG CTCAGGCGTTTAATA-3′和引物 4：3′-GCAATTGG ACACCAAATGGTGTTACTTTG-5′， 通過(guò)菌落 PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 挑選鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，使用LB 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h 后提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒再經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化方法如下：從-80 ℃中取出制備好的感受態(tài)， 將菌液握化于手心，4 500 g、4 ℃離心45 s，在超凈臺(tái)中移去上清液，用等體積的PEG 緩沖液懸浮細(xì)胞， 加入適量重組質(zhì)粒pNC-HisTSMNE 混勻后直接電擊。 電擊完畢立即加入800 μL MT 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng) 1.5 h 后涂布含 75 μg/mL新霉素的瓊脂糖平板。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR 和提質(zhì)粒測(cè)序兩種方法鑒定，并保留菌液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 bSMNE 的表達(dá)條件 篩選及純化對(duì)短短芽孢桿菌的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量活化，24 h 后取樣離心收集上清液， 以如下體系進(jìn)行粗酶活測(cè)定：3 μg λDNA，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，pH 8.0；3 μL 上清液，無(wú)菌水將體系補(bǔ)充至 50 μL。 37 ℃溫育5 min 后通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)λDNA 消化程度。 選擇活性較好的菌株在T2 培養(yǎng)基中進(jìn)行小量活化，再按照1∶50 的比例擴(kuò)大發(fā)酵，并進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。 24、27、30、37 ℃不同發(fā)酵條件下 120 r/min 持續(xù)培養(yǎng)60 h 后取上清液測(cè)定菌密度A600及上清液活性。 之后在T2 培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)5%的甘油在120 r/min、30 ℃下持續(xù)培養(yǎng) 60 h 為實(shí)驗(yàn)組， 不加甘油為對(duì)照組，同樣測(cè)定菌密度和培養(yǎng)上清液中目的蛋白質(zhì)活性以確定最佳表達(dá)條件。 最后，根據(jù)最佳發(fā)酵條件30 ℃、120 r/min， 以同樣的檢測(cè)參數(shù)確定目的蛋白質(zhì)最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)， 并設(shè)計(jì)含pNC-HisT 空載體的菌株作為對(duì)照組。

發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)10 000 g、4 ℃離心30 min 收集發(fā)酵上清液。 含有重組核酸酶bSMNE 的上清液組分經(jīng)過(guò) Ni2+親和層析初步純化 （Toyopearl AFChelate-650M，自填 1.25 cm×8 cm，共 15 mL）和凝膠阻滯層析進(jìn)行精細(xì)純化 （Hiload 16/200 Superdex 200 pg，GE Healthcare；120 mL）。 Ni2+親和層析過(guò)程中使用的緩沖液成分如下： 平衡緩沖液1×PBS，體積分?jǐn)?shù)5%甘油，5 mmol/L 咪唑； 漂洗緩沖液 1×PBS，體積分?jǐn)?shù)5%甘油，30 mmol/L 咪唑；洗脫緩沖液 1×PBS，體積分?jǐn)?shù) 5%甘油，200 mmol/L 咪唑。 凝膠阻滯層析使用的緩沖液成分如下：100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA， 2 mmol/L DTT，pH 8.0。 含有 bSMNE 的洗脫峰合并后，加入等體積甘油，長(zhǎng)期保存于-20 ℃，整個(gè)純化過(guò)程保持低溫。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度使用Bradford 法，以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 bSMNE 的酶活測(cè)定 根據(jù) GB/T 34801-2017 中脫氧核糖核酸酶活力檢測(cè)方法對(duì)酶活進(jìn)行定義。 將商業(yè)化重組SMNE 為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)計(jì)不加底物和不加酶液的相同體系作為對(duì)照組，并在檢測(cè)后作為背景值被減除，使用96 孔板在BioTek Synergy Neo2 酶標(biāo)儀中檢測(cè)反應(yīng)液每分鐘在260 nm 處的吸光值變化，連續(xù)監(jiān)測(cè)10 min。 將上述純化得到的bSMNE 進(jìn)行梯度稀釋， 使用相同的方法檢測(cè)260 nm 吸光值變化， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算bSMNE 的活性。 在SMNE 最適的反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)能夠引起A260值變化0.001 的酶量定義為1 U。 使用OriginPro2017 軟件處理分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 溫度及pH 對(duì) bSMNE 活性的影響 根據(jù)1.2.3 描述的活性測(cè)定方法， 在4~85 ℃范圍內(nèi)，以10 ℃為梯度，對(duì) bSMNE 進(jìn)行活性測(cè)定。 在 pH 對(duì)活性影響測(cè)試中，以2 mol/L HCl 和2 mol/L NaOH 對(duì)基礎(chǔ)pH 進(jìn)行調(diào)節(jié)，檢測(cè)bSMNE 在pH 4~11 范圍內(nèi)的活性。 使用OriginPro2017 軟件處理分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 鹽離子濃度對(duì)bSMNE 活性的影響 根據(jù)1.2.3 描述的活性測(cè)定方法， 測(cè)試從50~400 mmol/L范圍內(nèi)， 以 100 mmol/L 為梯度檢測(cè) Na+/K+對(duì)bSMNE 活性的影響。 此外，以每 1 mmol/L 為梯度，測(cè)試 1~10 mmol/L 范圍內(nèi) Mg2+/Mn2+對(duì) bSMNE 活性的影響。 使用OriginPro2017 軟件處理分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 bSMNE 應(yīng)用于細(xì)胞破碎液的核酸消化試驗(yàn)將培養(yǎng)所得的大腸桿菌JM109 離心后稱質(zhì)量，按照質(zhì)量比1：5 的比例用緩沖液重懸后破碎。 將上述純化得到的重組bSMNE 按照100 U/mL 細(xì)胞破碎液的比例加入到細(xì)胞破碎液樣品中，選擇pH 同為7.4的Tris 緩沖體系和PBS 緩沖體系重懸并破碎的兩組細(xì)胞破碎液樣品進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)組1 為1 mmol/L Mg2+時(shí)，bSMNE 在 4、25、37 ℃下分別消化兩組細(xì)胞破碎液 30 min； 實(shí)驗(yàn)組 2 為不存在 Mg2+時(shí)，bSMNE在4、25、37 ℃下對(duì)分別消化兩組細(xì)胞破碎液30 min，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 bSMNE 的構(gòu)建與表達(dá)

盡管在理論上利用芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)行核酸酶等毒性蛋白質(zhì)的表達(dá)具有優(yōu)勢(shì)，但該系統(tǒng)相較于大腸桿菌表達(dá)體系存在轉(zhuǎn)化效率較低的問(wèn)題，重組表達(dá)載體構(gòu)建難度較大。 因此，作者選擇大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pNC-HisT 作為重組表達(dá)載體，先在大腸桿菌中完成SMNE 基因的克隆，然后再轉(zhuǎn)入到短短芽孢桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。 穿梭質(zhì)粒pNCHisT 基本元件見(jiàn)圖1（a）。不同的抗性篩選標(biāo)記便于分別在大腸桿菌和短短芽孢桿菌中進(jìn)行篩選。 首先利用無(wú)縫克隆原理將SMNE 基因片段與線性化的pNC-HisT 載體進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選10~12 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 鑒定。 如圖 1（b）所示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子“1”和“2”的擴(kuò)增片段大小約 1 200 bp，與預(yù)期的理論大小（1 216 bp）一致。 隨后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送公司測(cè)序， 確認(rèn)構(gòu)建正確無(wú)誤后，轉(zhuǎn)化入短短芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子同樣進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在短短芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，不同陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)效率和產(chǎn)物活性差別較大，因此在構(gòu)建完成后， 作者選取5~7 個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行活化，提取其上清液初步測(cè)定酶活， 篩選酶活高的轉(zhuǎn)化子。不同轉(zhuǎn)化子在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)λDNA 的消化程度不同： 消化程度越高， 條帶殘留量越低， 結(jié)果見(jiàn)圖1（c）。 泳道 1、2、3 中幾乎沒(méi)有 λDNA 條帶的殘留，消化效果明顯，因此選擇泳道1、2、3 對(duì)應(yīng)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 bSMNE 表達(dá)條件的優(yōu)化

雖然B.choshinenesis SP3 系統(tǒng)具有優(yōu)異的分泌異源蛋白質(zhì)的能力，但對(duì)于不同類型的外源蛋白質(zhì)表達(dá)，其培養(yǎng)條件也不盡相同。 作者首先對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行了篩選，結(jié)果見(jiàn)圖 2（a）。 在 24 ℃和 27 ℃下bSMNE 活性較低，菌體量也較少，表明短短芽孢桿菌的生長(zhǎng)在此溫度條件下受到一定抑制，外源蛋白質(zhì)的表達(dá)活性也受到影響。 在30 ℃和33 ℃培養(yǎng)條件下，盡管菌體量無(wú)明顯提高，但bSMNE 活性明顯增強(qiáng)，尤其是在30 ℃發(fā)酵溫度下，bSMNE 的活性最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇30 ℃作為最適發(fā)酵溫度。

短短芽孢桿菌有相對(duì)較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，通常在48 h 以上，且利用該系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白質(zhì)直接外泌至培養(yǎng)基中， 因此目的蛋白質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中，缺乏有效保護(hù)，容易受到諸如菌體代謝引起培養(yǎng)基pH 變化等不利因素的影響。 在一些B.choshinenesis SP3 重組表達(dá)的研究中， 研究者發(fā)現(xiàn)氨基酸（尤其是脯氨酸）對(duì)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用， 其他添加劑諸如TWEEN[20]、山梨醇[21]對(duì)外源蛋白質(zhì)也有一定的保護(hù)作用。另外，甘油作為潤(rùn)滑劑，在菌體培養(yǎng)過(guò)程中能夠減少菌體間由于摩擦引起的細(xì)胞損傷， 并且甘油親水性極佳，在培養(yǎng)基中能夠結(jié)合大量的水，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 因此加入體積分?jǐn)?shù)5%甘油到發(fā)酵培養(yǎng)基中，試圖探究其對(duì)于外源蛋白質(zhì)的表達(dá)是否有積極作用。結(jié)果如圖2（b）所示：與不含甘油的培養(yǎng)物相比，加入體積分?jǐn)?shù)5%甘油使bSMNE 蛋白質(zhì)活性增加6倍。 然而甘油對(duì)B.choshinenesis SP3 的生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，菌體量沒(méi)有顯著增加，推測(cè)甘油促進(jìn)bSMNE 蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中積累的原因與酵母利用甘油作為碳源來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)生成的機(jī)制不同，可能主要通過(guò)物理作用穩(wěn)定外源蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中的狀態(tài)，從而在經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間后仍能獲得理想的活性蛋白質(zhì)。

最后， 對(duì)bSMNE 在短短芽孢桿菌中的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，以確定其最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間。 如圖2（c）所示，菌體密度在32 h 時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期（A600=2.187 4）并維持超過(guò)40 h。 然而，bSMNE 的活性在培養(yǎng)56 h后達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)。綜上，確定的bSMNE最佳發(fā)酵條件是在T2G 培養(yǎng)基中于30 ℃下培養(yǎng)56 h。

2.3 bSMNE 的純化與活性測(cè)試

圖2 bSMNE 表達(dá)條件的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of protein expression conditions

bSMNE 重組蛋白質(zhì)純化流程見(jiàn)圖 3（a），是該表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)典的純化流程之一。 對(duì)離心后收集的上清液進(jìn)行色譜層析純化， 利用重組bSMNE 上所帶的6xHis 標(biāo)簽， 使用Ni2+親和層析富集上清液中的bSMNE，通過(guò)咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。經(jīng)Ni2+親和層析純化后，重組 bSMNE 純度已經(jīng)達(dá)到 90%以上（圖 3（b））。最后對(duì)洗脫液富集后再進(jìn)行凝膠阻滯層析。 如圖3（c）和表 1 所示，經(jīng)凝膠阻滯層析后，bSMNE 純度及比活力并沒(méi)有明顯提高，且回收率有所下降，最終回收率為84%，經(jīng)Bradford 法檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度僅為 0.12 mg/mL。上述結(jié)果顯示：在B.choshinenesis中重組表達(dá)SMNE， 僅需一步親和層析就能獲得高比活目的蛋白質(zhì)，純化流程中的最后一步凝膠阻滯層析可略去。 純化后的bSMNE 以商業(yè)化酶活定義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行酶活測(cè)定。 將3 種商業(yè)化Benzonase 按其標(biāo)稱酶活梯度稀釋后，消化底物，檢測(cè)實(shí)際的260 nm吸光值變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3 種商業(yè)化酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本完全吻合，見(jiàn)圖4，可以用來(lái)測(cè)定酶活。因此，將重組表達(dá)的bSMNE 梯度稀釋后，在相同體系下，檢測(cè)260 nm 吸光值變化，見(jiàn)表2，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。 經(jīng)計(jì)算 bSMNE 比活力可達(dá) 1.3 × 107U/mg，相較在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的商業(yè)化酶提高了2~3倍。 這一結(jié)果證實(shí)短短芽孢桿菌B.choshinenesis SP3 在表達(dá)bSMNE 上更具有優(yōu)勢(shì)。分析其原因主要有： 其一，SMNE 本身是一種胞外分泌型核酸酶，因此短短芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為一種胞外分泌表達(dá)系統(tǒng)，相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，更容易使SMNE 形成正確的活性構(gòu)象，更易獲得比活力高的蛋白質(zhì)；其二，本實(shí)驗(yàn)使用的表達(dá)載體是用芽孢桿菌內(nèi)源細(xì)胞壁蛋白質(zhì)信號(hào)肽取代了SMNE 自身來(lái)源的信號(hào)肽，并使用芽孢桿菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)基因的特異型啟動(dòng)子P2，這樣有利于芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后， 外源SMNE基因?qū)崿F(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄，從而使SMNE 蛋白質(zhì)在隨后較長(zhǎng)的穩(wěn)定期得以大量積累。

圖3 bSMNE 純化流程及SDS-PAGE 分析Fig. 3 Purification of bSMNE and SDS-PAEG analysis of the purification of bSMNE

表1 bSMNE 純化流程中蛋白質(zhì)質(zhì)量、比活力、純度及回收率Table 1 The amount of bSMNE，specific activity，purity and recovery during each process

2.4 bSMNE 在不同條件下活性測(cè)試

2.4.1 不同溫度及pH 對(duì)bSMNE 活性的影響 對(duì)不同溫度及pH 條件下bSMNE 的活性進(jìn)行了檢測(cè)。分別以37 ℃和pH 8.0 下的活性作為100%酶活標(biāo)準(zhǔn)， 計(jì)算不同溫度或pH 值下bSMNE 的相對(duì)活性。在不同溫度下的活性見(jiàn)圖5（a）。 在低溫條件下（4~25 ℃），bSMNE 僅有 8%~20%的活性；37 ℃達(dá)到最佳酶活，在45 ℃時(shí)酶活還可以保持80%以上；之后隨著溫度繼續(xù)提高活性逐漸下降， 在85 ℃時(shí)僅存12%左右的活性。而不同pH 值下的活性變化見(jiàn)圖5（b）。 pH 5 以下幾乎無(wú)活性，pH 6~7 時(shí) bSMNE 活性僅為標(biāo)準(zhǔn)活性的9%~25%，最適pH 區(qū)間為8~9。

圖4 bSMNE 活性測(cè)試Fig. 4 Activity analysis of bSMNE

表2 bSMNE 梯度稀釋表及相應(yīng)的ΔA260 值Table 2 The dilution ratio and ΔA260 value of bSMNE

2.4.2 不同鹽離子條件對(duì)bSMNE 活性的影響 作者檢測(cè)了不同濃度的Mg2+和Mn2+兩種二價(jià)陽(yáng)離子，以及Na+和K+的兩種一價(jià)陽(yáng)離子對(duì)重組bSMNE 活性的影響。 如圖 5（c）所示，bSMNE 在沒(méi)有二價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí)仍然保持有47%的活性； 隨著Mg2+/Mn2+的加入， 其活性快速上升； 但1 mmol/L 以上濃度的Mg2+/Mn2+對(duì)bSMNE 活性不再有繼續(xù)促進(jìn)作用。 另外，Mg2+對(duì) bSMNE 酶活促進(jìn)效果相對(duì)Mn2+較好，相同濃度的 Mn2+條件下，bSMNE 活性僅為 Mg2+的80%。 而對(duì)于一價(jià)陽(yáng)離子而言， 如圖 5 （d） 所示，bSMNE 在300 mmol/L Na+/K+條件下仍然保持35%~45%活性。 該結(jié)果表明,在 B.choshinenesis SP3 中重組表達(dá)的bSMNE 表現(xiàn)出了更廣的一價(jià)陽(yáng)離子適應(yīng)性。

2.5 不同緩沖體系對(duì)bSMNE 活性的影響

不同緩沖體系下bSMNE 的活性表現(xiàn)， 能體現(xiàn)該酶的應(yīng)用潛力，因此作者檢測(cè)了在不同緩沖體系下bSMNE 對(duì)大腸桿菌裂解液的消化能力。 如圖6所示，Mg2+對(duì)bSMNE 消化裂解液的能力并沒(méi)有明顯影響， 這可能是因?yàn)榇竽c桿菌胞內(nèi)本身存在Mg2+，隨著高壓破碎后一并溶解在破碎液中。 在Tris 和PBS 緩沖體系中，bSMNE 的活性并無(wú)明顯差異，4 ℃和25 ℃條件下bSMNE 的消化能力遠(yuǎn)低于37 ℃。該結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖5 不同條件對(duì)bSMNE 活性的影響Fig. 5 Effects of different conditions on activity

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究使用短短芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了SMNE 的重組表達(dá)，并通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件獲得較為理想的目標(biāo)蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)最適發(fā)酵條件為30 ℃下發(fā)酵56 h，最適發(fā)酵培養(yǎng)基為T(mén)2G 培養(yǎng)基。 在該系統(tǒng)中， 通過(guò)一步親和層析即可獲得30~40 mg/dL的目的蛋白質(zhì)，產(chǎn)量可達(dá)109U/L，遠(yuǎn)高于大腸桿菌中106U/L 的產(chǎn)量。 本研究為后續(xù)利用短短芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)SMNE 的大規(guī)模發(fā)酵提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他核酸酶的重組表達(dá)提供了新的思路。