人工抗氧化肽的設計、表達純化及功能表征

堯馨慧 ， 張云豐 ， 康 振 ， 陳 堅 *

（1. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122）

在D. Harmen 提出自由基學說后[1]，隨著研究的深入，人們逐漸認識到人體衰老和許多疾病與自由基的產(chǎn)生相關。 生物體內的抗氧化體系主要包括抗氧化酶、低相對分子質量非酶抗氧化劑、分隔過渡金屬的蛋白質等自由基清除劑[2]。 當機體內活性氧分子（ROS）大量積累，會導致機體處于氧化應激狀態(tài)，并氧化損傷DNA、RNA、線粒體等生物分子，引起細胞死亡和組織損傷[3]。 因此，具有自由基清除作用的抗氧化劑在藥品、化妝品、食品和保健品中具有很大的應用價值。

將動植物來源的生物活性肽或蛋白質水解物作為天然抗氧化劑是當前的一大研究熱點。 蛋白質水解物是將提取得到的大分子蛋白質通過酶解、酸解、堿處理或生物發(fā)酵等方式分解成具有生物活性的寡肽，如已報道的雞血水解物[4]、鯖魚蛋白水解物[5]、雞蛋水解物[6]、發(fā)酵乳水解物[7]、阿魏菇水解物[8]、羊胎盤水解物[9]、螺旋藻水解物[10]等。一般而言，具有生物活性的肽通常由2~20 個氨基酸構成[11]，相對分子質量小于6 000[12]，而具有抗氧化活性的肽一般由5~16 個氨基酸殘基組成[13]。

目前關于抗氧化肽的研究主要集中在蛋白質水解物中的肽的分離、純化和鑒定，但鮮有關于生物法制備特定序列的寡肽的報道。 對于微生物法直接表達寡肽而言，存在兩個較大的難點：其一是寡肽極小的相對分子質量導致其在表達過程中難以正常的進行轉錄和翻譯；其二是表達出的寡肽較難使用簡單的、可工業(yè)化的策略進行純化。 在工業(yè)生產(chǎn)中，小分子肽的生產(chǎn)仍以化學合成為主，但化學法反應條件復雜且純化過程繁瑣。

針對上述微生物法直接表達寡肽的難點，作者提出表達串聯(lián)寡肽的新思路，將表達小分子寡肽變?yōu)楸磉_合適相對分子質量的多肽蛋白質。 根據(jù)抗氧化肽的二級結構、氨基酸組成、親疏水性、帶電性等特點[14-18]，結合本課題組前期關于抗氧化寡肽的高通量篩選結果，人工設計了3 條由不同寡肽串聯(lián)組成的氨基酸序列， 分別命名為ATO、ATW 和WIT。這些寡肽序列的C 端均為可被胰蛋白酶特異性識別和切割的Arg 或Lys。 同時，本課題組前期構建的高產(chǎn)胰蛋白酶的P. pastoris 工程菌[19-20]，為酶解法制備寡肽提供了工業(yè)化的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒 克隆宿主E. coli JM109、 表達宿主 E. coli BL21 （DE3）、 大 腸 桿 菌 表 達 載 體pRSFDuet-1 等均為作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Prime STAR （HS） DNA 聚合酶、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒：購自TaKaRa 公司；一步克隆試劑盒： 購自 Vazyme 公司；SDS-PAGE 試劑盒、蛋白質電泳marker： 購自碧云天公司；BCA 蛋白質含量檢測試劑盒： 購自上海生工生物工程有限公司，引物和基因合成及測序服務也由該公司完成；胰蛋白酶（Trypsin）：由作者所在實驗室構建的重組菌經(jīng)發(fā)酵及純化而得[20]；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，自然 pH。 固體培養(yǎng)基另添加20 g/L 瓊脂粉。

TB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油 4 g/L，K2HPO42.31 g/L，KH2PO412.54 g/L。

1.2 菌株構建

根據(jù)本課題組前期研究成果，篩選得到了一系列具有抗氧化功能的寡肽序列。 在此基礎上，將這些具有抗氧化性的且C 端為Arg 或Lys 的不同寡肽進行串聯(lián)，人工設計了3 條多肽序列，分別命名為ATO、ATW 和 WIT，見表 1。

經(jīng)大腸桿菌宿主密碼子優(yōu)化后，全基因合成上述多肽的基因序列，且在其N 端添加His 標簽和胰蛋白酶切割位點以便于表達和純化。 用表2 中的引物擴增目的基因序列，添加上下游同源臂，采用一步克隆的方式將擴增得到的序列連接至線性化的pRSFDuet-1 載體上，連接位點為NcoⅠ和HindⅢ。構建表達載體 pRSFDuet1-His-ATO、pRSFDuet1-His-ATW 和pRSFDuet1-His-WIT，分別轉化E. coli JM109 感受態(tài)細胞。進行菌落PCR 和瓊脂糖凝膠電泳驗證，并進行測序。 構建成功的質粒分別轉化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞得到3 株重組菌。

1.3 重組大腸桿菌的發(fā)酵

種子培養(yǎng)： 挑取單菌落接種于含50 μg/L 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，250 mL 離心管裝液量為30 mL。在37 ℃、220 r/min 條件下振蕩過夜培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵： 將種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)1%轉接至含 50 μg/L 卡那霉素的 TB 培養(yǎng)基中，250 mL 搖瓶裝液量為 50 mL。 在 37 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)至OD600值為0.6~0.8，添加終濃度為1 mmol/L IPTG進行誘導，37 ℃誘導6 h。

表1 人工設計的多肽序列Table 1 Polypeptide sequences designed artificially

表2 本文所用的引物Table 2 Primers used in this study

發(fā)酵液于 8 000 r/min、4 ℃下離心 10 min，收集菌體。菌體洗滌2 次后重懸于20 mmol/L、pH 7.5的PBS 緩沖液中進行超聲破碎。 破碎液12 000 r/min、4 ℃下高速離心20 min， 取上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.4 多肽的純化

破碎上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾， 使用AKTA蛋白質純化儀及Ni-NTA 親和層析柱進行蛋白質純化。

上樣及平衡緩沖液A （20 mmol/L NaH2PONa2HPO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.8），洗脫液 B（20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.8）。 依次使用體積分數(shù) 10%、30%、50%、100%的洗脫液 B 進行梯度洗脫，每個梯度洗脫10 個柱體積，收集蛋白質峰。 通過SDS-PAGE 電泳檢測蛋白質純度，并將純化得到的多肽透析脫鹽。

1.5 寡肽的水解制備

使用由畢赤酵母工程菌發(fā)酵并純化得到的胰蛋白酶（200 U/mL）水解上述多肽，加酶量為體積分數(shù)的5%，37 ℃下酶解4 h。 反應結束后，立即70 ℃水浴加熱 10 min 使酶滅活。 在 7 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，得到3 種混合寡肽溶液。

使用相對分子質量3 000 的超濾濃縮管對寡肽溶液進行濃縮， 留取含小相對分子質量物質的溶液，并使用BCA 法測定蛋白質質量濃度。

1.6 抗氧化性測定

1.6.1 對DPPH 自由基的清除能力測定 測定方法在文獻[21]方法的基礎上有所改動。 以維生素C（VC） 為對照， 使用無水乙醇配制 4×10-4mol/L 的DPPH 溶液，避光保存。

取 750 μL 待測樣品于 1.5 mL EP 管中， 加入750 μL DPPH 溶液， 混勻后避光靜置 30 min，10 000 r/min 離心 5 min。 取 200 μL 上清液于 96 孔板，在吸收波長517 nm 處測其吸光度D1；另取同樣量待測樣品加入無水乙醇重復上述操作，測得的結果記為D2；取同樣量DPPH 溶液加入無水乙醇重復上述操作，結果記為D0。 DPPH 自由基清除率CD計算公式如下：

1.6.2 對超氧陰離子自由基的清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化法[22]。 以VC 作為對照，配制0.1 mol/L 的 Tris-HCl（pH 8.2）溶液。 使用 0.1 mol/L的HCl 溶液溶解鄰苯三酚，配為0.75 mmol/L 的鄰苯三酚水溶液。

將 15 μL 待測液和 170 μL Tris-HCl 加入 96孔板，37 ℃保溫振蕩 20 min 后加入 15 μL 鄰苯三酚溶液， 振蕩混勻后立即測吸收波長為325 nm 處的吸光值。每隔30 秒測定一次，反應時間3 min。繪制吸光值A 隨時間變化的曲線，斜率即為鄰苯三酚自氧化率V（ΔA/min）。超氧陰離子自由基清除率CV計算公式如下：

其中：V0為空白組的鄰苯三酚自氧化率；V1為實驗組的鄰苯三酚自氧化率。

1.6.3 對羥基自由基的清除能力測定 測定方法在文獻[23]方法的基礎上有所改動。 以VC 為對照。使用無水乙醇配制0.75 mmol/L 的鄰二氮菲溶液，配制 0.75 mmol/L 的 FeSO4溶液，配制 0.15 mol/L 的PBS 緩沖液（pH 7.4）。

在96 孔板中依次加入35 μL 鄰二氮菲溶液、70 μL PBS 緩沖液、 35 μL FeSO4溶液、35 μL 樣品和 35 μL H2O2，混勻后 37 ℃保溫振蕩 1 h，測吸收波長在536 nm 處的吸光值A2； 另取同樣量蒸餾水替代樣品重復上述操作， 測得的吸光值記為A0；取同樣量蒸餾水替代樣品和H2O2重復上述操作，測得的吸光值記為A1。 羥基自由基清除率CA計算公式如下：

1.6.4 半抑制濃度IC50的測定 將對照VC 及3 種多肽水解物樣品梯度稀釋成不同質量濃度，分別測定其不同質量濃度時的DPPH 自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥基自由基清除率。 以樣品質量濃度為橫坐標，清除率測定值為縱坐標，使用origin 軟件繪制擬合曲線，并計算半抑制濃度IC50值。

2 結果與分析

2.1 重組抗氧化肽的構建

以pRS-F 和pRS-R 為上下游引物線性化載體pRSFDuet-1。以合成的基因ATO 為模板，以P-F 和ATO-R 為引物進行擴增；以合成的基因ATW 為模板，以P-F 和ATW-R 為引物進行擴增；以合成的基因WIT 為模板， 以P-F 和WIT-R 為引物進行擴增。 使用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進行膠回收，回收后得到的具有pRSFDuet-1 載體上下游同源臂的ATO、ATW 和WIT 片段分別和線性化的pRSFDuet-1載體片段同源重組，轉化E.coli JM109 感受態(tài)細胞。

以轉化空質粒pRSFDuet-1 的E. coli JM109 為對照，挑取轉化子進行菌落PCR 驗證，見圖1。2 號、6 號、7 號和10 號泳道含有大小正確且清晰的目的基因條帶，約 350 bp。將 2 號、6 號和 10 號菌提取質粒交由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果正確， 得到構建成功的重組載體pRSFDuet1-His-ATO、pRSFDuet1-His-ATW 和 pRSFDuet1 -His -WIT。分別轉化 E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，得到E. coli BL21 （DE3）- pRSFDuet1-His-ATO、E. coli BL21（DE3）- pRSFDuet1-His-ATW 和 E. coli BL21（DE3）- pRSFDuet1-His-WIT 重組菌。

圖1 重組大腸桿菌的PCR 鑒定Fig. 1 Identification of recombinant E. coli by PCR

2.2 重組肽的表達分析

以轉化空 pRSFDuet-1 質粒的 E. coli BL21（DE3）-pRSFDuet1 為對照，挑取構建成功的 E. coli BL21 （DE3）-pRSFDuet1-His-ATO、E. coli BL21（DE3）-pRSFDuet1-His-ATW 和 E. coli BL21（DE3）-pRSFDuet1-His-WIT 單菌落進行搖瓶發(fā)酵， 發(fā)酵結束后離心收集菌體并超聲破碎，對其胞內上清液進行SDS-PAGE 分析，結果見圖2。 與對照相比，3株重組菌胞內上清液中均可明顯檢測到大小約為14 000 的蛋白質條帶，即 ATO、ATW 和 WIT 多肽均能在E. coli 胞質中以可溶性形式進行表達。

2.3 重組肽的純化與酶解

使用Ni-NTA 親和層析柱對重組大腸桿菌的胞內上清液進行純化， 當梯度洗脫的咪唑濃度為200 mmol/L 時可洗脫得到純化的多肽， 見圖3。 其中，ATO 多肽相對分子質量約為13 000，ATW 和WIT多肽相對分子質量約為14 000，均符合理性設計多肽的預期大小，透析后可得到脫鹽的多肽溶液。

圖2 重組大腸桿菌蛋白質表達的SDS-PAGE 分析Fig. 2 Analysis of the products expressed in recombinant E. coli by SDS-PAGE

圖3 大腸桿菌胞內蛋白質純化結果的SDS-PAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE of purified sample extracted from the E. coli cultures

在多肽N 端的His 標簽與多肽序列之間，具有胰蛋白酶的特異性酶切位點，人工設計為Asp-Arg，Asp 有利于胰蛋白酶在Arg 處的高效切割。 使用胰蛋白酶水解ATO、ATW 和WIT 多肽溶液，能夠去掉N 端的His 標簽，并得到3 種混合多肽水解物。

經(jīng)超濾濃縮后，使用BCA 法測定ATO、ATW 和WIT 多肽水解物的蛋白質質量濃度分別為2.46、1.73、2.04 mg/mL。

2.4 多肽水解物的抗氧化性評價

通過測定多肽水解物對人工生成的自由基的清除能力來反映其抗氧化活性， 具體為測定對DPPH 自由基、 羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率，復合評價3 種多肽水解物的抗氧化性。

2.4.1 對DPPH 自由基的清除能力 如圖4 所示，對照VC 在較低質量濃度時對DPPH 自由基就能夠達到極好的清除效果，其IC50＜0.05 mg/mL，且當VC質量濃度不低于0.2 mg/mL 時， 清除率即可達到100%。 3 種多肽水解物對DPPH 自由基均具有清除效果，清除能力隨著質量濃度的增加而增強，其中ATW 多肽水解物對DPPH 自由基的清除能力最強。3 種多肽水解物對DPPH 自由基的清除效果均不如VC。ATO、ATW 和 WIT 多肽水解物對 DPPH 自由基的 IC50值依次為 0.69、0.53、0.76 mg/mL。

圖4 多肽水解物的DPPH 自由基清除能力Fig. 4 Activities of scavenging DPPH radical of the polypeptide hydrolysates

2.4.2 對超氧陰離子自由基的清除能力 3 種多肽水解物對超氧陰離子自由基均具有清除效果，見圖5。 對照 VC、ATO 多肽水解物、ATW 多肽水解物和WIT 多肽水解物對超氧陰離子自由基的IC50值依次為 0.48、0.90、0.45、0.90 mg/mL。 值得關注的是，ATW 多肽水解物的半抑制質量濃度略低于VC；ATO 和WIT 多肽水解物的半抑制濃度相同，但高于VC。在較低質量濃度（＜0.4 mg/mL）時，3 種多肽水解物均表現(xiàn)出了對超氧陰離子自由基很好的清除效果，明顯優(yōu)于對照VC；但隨著質量濃度的增高，清除率最終都低于VC。 由此可知， 在較低質量濃度下，小分子的肽類對超氧陰離子自由基的清除更有優(yōu)勢。

圖5 多肽水解物的超氧陰離子自由基清除能力Fig. 5 Activities of scavenging superoxide anion of the polypeptide hydrolysates

2.4.3 對羥基自由基的清除能力 3 種多肽水解物對羥基自由基均具有清除能力。 如圖6 所示，在質量濃度低于0.1 mg/mL 時，ATW 多肽水解物表現(xiàn)出了強于VC 的清除力效果，但隨著質量濃度的增加，仍弱于 VC。 對照 VC、ATO 多肽水解物、ATW 多肽水解物和WIT 多肽水解物對羥基自由基的IC50值依次為 0.20、1.06、0.34、1.24 mg/mL。 ATW 多肽水解物對羥基自由基的清除效果明顯優(yōu)于另外兩種多肽水解物。

圖6 多肽水解物的羥基自由基清除能力Fig. 6 Activities of scavenging hydroxyl radical of the polypeptide hydrolysates

2.4.4 多肽水解前后抗氧化活性比較 3 種多肽及多肽水解物均具有抗氧化活性，但相同蛋白質濃度時，水解物的抗氧化活性遠高于水解前的大分子多肽。 以ATW 多肽和ATW 多肽水解物為例，當樣品質量濃度為 0.5 mg/mL 時， 如圖 7 所示，ATW 多肽水解物對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為水解前的 4.39、15.71 和6.71 倍。ATO 多肽和WIT 多肽也表現(xiàn)出了相似的趨勢。 結果表明，通過大腸桿菌直接表達出的3 種多肽并沒有很好的抗氧化活性，是通過胰蛋白酶的水解作用，獲得了具有抗氧化活性的功能性寡肽。

圖7 多肽水解前后的抗氧化性比較Fig. 7 Antioxidant activity of polypeptide before and after hydrolysis

3 結 語

作者在E. coli 中成功表達了3 種多肽，且均以可溶形式在胞質中存在。 通過親和層析、透析脫鹽、胰蛋白酶水解和超濾濃縮等流程得到了3 種不同的多肽水解物。DPPH 自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥基自由基清除率等體外抗氧化性測定結果表明，3 種多肽水解物均具有清除自由基的效果。 在較低質量濃度時，ATW 多肽對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除效果甚至優(yōu)于對照VC。 ATW 多肽水解物在3 種多肽水解物中具有最強的抗氧化性，對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的 IC50值分別為 0.53、0.45、0.34 mg/mL。 生物酶法為制備功能性寡肽提供了一種新思路， 同時本研究得到的一組抗氧化肽在食品、藥品和化妝品中具有廣闊的應用前景。