成年人血DDT含量與DNA氧化損傷及糖脂代謝的關聯研究

劉亞航，徐曉凡，趙慧

【摘要】目的：探究成年人血滴滴涕（DDT）水平與DNA氧化損傷及糖脂代謝的關聯，以及DDT是否通過氧化損傷DNA影響糖脂代謝。方法：本研究以武漢社區隊列漢口、漢陽2個社區的居民603名。通過問卷調查收集個人基本信息和生活習慣及職業史等信息，通過體檢檢測血糖血脂平，并收集空腹外周血和隨機尿樣。本研究采用GC-MS/MS測定研究對象的血清中DDT水平，以此評估人群DDT的內暴露量;采用高效液相色譜法測定DNA氧化損傷標志物：尿8-OHdG水平，采用線性回歸模型分析DDT與尿8-OHdG、血糖水平、血脂水平、糖尿病以及高脂血癥的關聯;采用中介分析法分析8-OHdG在DDT與糖脂代謝關聯中的中介效應，為機制探索提供一定依據。結果：血中pp’-DDT水平與血糖和血脂有明顯關聯，暫不能排除8-OHdG的中介作用。

【關鍵詞】DDT;8-OHdG;血糖;血脂;中介效應分析

【中圖分類號】R363 【文獻標識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.13.253

DDT是一種持久性有機污染物（persistentorganicpollutants，POPs），具有高毒性、持久性、積累性和遷移性。近年來我們我國居民體內DDT水平是否發生變化尚未可知。本研究通過檢測一般城市居民血中DDT含量來評估DDT的殘留情況。既往研究多關注DDT的致癌性和生殖毒性，而較少有研究關注DDT對代謝性疾病的影響。糖尿病和高脂血癥是環境相關性代謝性疾病。多項研究表明，發生與多種因素相關，另外，DDT暴露可誘導機體的氧化應激和系統炎癥，而氧化損傷是糖尿病和高脂血癥等代謝性疾病的重要致病機制。

基此，本研究以中國城市成年居民為研究對象，探討DDT對血脂代謝的影響以及其部分機制，為綜合防控糖尿病和高脂血癥提供一定的科學依據。8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是由ROS介導的氧化性損傷的主要代表形式，故選取尿8-OHdG作為評價機體氧化性DNA損傷的標志。肌酐是人體內生代謝產物，其生成和排泄均較恒定，此為了排除因尿液稀釋和個體差異等因素的影響，用尿肌酐來校正尿8-OHdG。

1 資料與方法

1.1資料來源

研究對象來自武漢社區隊列。本部分數據來自長期居住在武漢市漢陽江漢小區和湖濱小區的成年居民共603人。排除因血樣不足以檢測DDT數據的樣本（n=168）后，有435人有齊全的血DDT檢測數據。排除因尿樣不足以檢測8-OHdG和尿肌酐數據的樣本（n=30），并在此基礎上，排除自報有患有糖尿病、高血脂、腫瘤、中風、心梗、慢阻肺、肺氣腫、關節炎、胸膜炎、肝炎或腎炎的部分，其余（n=351）納入本部分研究。

所有研究對象均簽署知情同意書。本研究獲得華中科技大學同濟醫學院倫理委員會批準。

1.2試劑

標準農藥混合試劑（PesticideMix17）、正己烷、二氯甲烷（DCM）、8-OHdG標準品購于美國Sigma公司;分析純尿素購于上海國藥控股化學試劑有限公司;HPLC級甲醇為德國Merck公司產品;磷酸二氫鉀、乙酸、檸檬酸和乙二胺四乙酸（EDTA）為北京國藥集團化學試劑有限公司產品;氫氧化鈉試劑來自天津光復精細化工研究所;乙酸鈉來自天津科密歐試劑有限公司;肌酐（CREA）測定試劑購于深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;雙蒸水（監控室的純水）來自武漢市泓源企業;高純度氦氣（N99.999%）;去離子水。所有試劑使用前均用0.22μm微孔濾膜過濾。

1.3方法

1.3.1 血DDT水平測定

取出冰凍分裝的血漿（0.5ml）融化至室溫，離心混勻。加入13C6標記的HCB，再加入0.5mL去離子水，進行渦流。用500mg尿素對血漿蛋白進行變性處理，渦旋超聲處理25min。分離有機相至另一試管中，在40℃水浴下氮吹濃縮至0.5ml。將HLB固相萃取小柱裝在VacElutSPE24上，依次用3mLDCM、5mL甲醇和5mL去離子水進行淋洗。在最大真空度下抽真空干燥10min。

采用無分流方式將1μL提取液注入到配備了AgilentDB-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）毛細管柱的Agilent6890N-5975氣相色譜質譜聯用儀中，注射入口溫度設定為250℃。以高純度氦氣（N99.999%）為載氣，控制恒定流速為1.0mL/min。烘箱溫度程序設置為：初始溫度60℃保持1min，后每分鐘升高30℃至180℃保持1min，然后每分鐘升高7℃至280℃保持2min。使用MassHuntersoftware軟件進行儀器控制、數據采集與分析。

1.3.2 尿8-OhdG水平測定

取出冰凍分裝的2ml尿樣于38℃水浴融化，離心10min（4℃，5000rpm）。固相萃取（SPE）小柱的預處理：將BondElutLRCC18-OH固相萃取柱調為低真空密度。依次加入約10ml純甲醇、約5ml去離子水，約10ml0.1mol/LKH2PO4（pH6.0）沖洗。再用3ml去離子水淋洗，在最大真空度下抽真空干燥10min。尿液吸附、洗脫、收集，取1.5ml預處理尿樣過C18-OH固相萃取柱小柱。依次用3ml0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）、3ml5%甲醇淋洗，抽干5min。最后用1ml純甲醇洗脫SPE小柱吸附的尿樣，并收集洗脫液于1.5mlEp管，置于快速真空濃縮儀吹干甲醇（45℃，約3h，根據實際情況確定），4℃冰箱保存，進樣前用0.1mol/L的KH2PO4（pH=6.0）1ml定容。臨分析前，將樣品用針頭式濾器過濾至自動進樣小瓶;再從中取100：l與900：l過濾的0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）混勻，40℃保存。取20μl進樣檢測。并制備8-OhdG標準曲線。

1.3.3 尿肌酐測定

將冰凍分裝的尿樣于37℃水浴融化，混勻，再取10：l融化尿樣和490：l蒸餾水（比例可隨意，如1：19）置于1.5ml離心管中，用恒溫震蕩混勻器（1400R/37℃）混勻，剪去離心管蓋子，準備進樣檢測。

1.3.4 血生化水平測定

用全自動生化分析儀測定血糖濃度、TCHO和TG水平。

1.4統計學處理

樣本中血op’-DDT和pp’-DDT的濃度高于檢出限（99%），可納入研究。采用one-sampleKolmogorov-Smirnov檢驗研究變量的正態性分布;將血pp’-DDT 經box-cox轉換后、尿8OH-dG經自然對數轉換后（pp’-DDT^（-0.8739））納入研究，用Wilcoxon檢驗用于比較血DDT和尿8OH-dG在男女兩性中的差異;用logistics 回歸分析方法計算OR值和95%置信區間（95%CI），分析血 pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關性。用線性回歸分析方法分析血pp’-DDT 水平與尿8-OHdG水平的相關性;

2 結果

2.1 血DDT和尿 8-OHdG在不同性別中的差異分析

使用Wilcoxon檢驗在不同性別中，血中DDT和尿8-OHdG的分布差異無統計學意義（表1）。

2.2 城市居民血 DDT 與尿 8-OHdG的關聯性

根據尿8-OHdG水平的四分位數將研究人群分為 P25、P50、P75、P100四個組，以尿 8-OHdG最低濃度 P25 為對照組，用多元 logistics 回歸分析血 pp’-DDT 水平與尿 8-OHdG 水平的相關性，結果見表2。并用線性回歸模型進行分析，結果見表3。

2.3 血DDT、尿8-OHdG與糖脂代謝的關聯性

TG經k-s檢驗符合正態分布（D=0.066，P 值=0.07912）;血 TCHO經k-s檢驗符合正態分布（D=0.065，P 值=0.08227）;血糖經過 box-cox 轉換（GLU^（-2.4））后符合正態分布（D=0.068，P 值=0.06275）;用中介效應模型來分析血pp’-DDT、尿8-OHdG與糖脂代謝之間的相關性（表4）。

四分法logistics回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關性結果第六列是瓦爾德檢驗顯著性值（P值），此值大于0.05說明對應自變量（血pp’-DDT）的系數沒有統計學意義，沒有依據證明自變量（血pp’-DDT）對因變量（尿8-OHdG）不同分類水平的變化有顯著影響。

線性回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關性回歸系數檢驗表第六列的顯著性系數（P值）均大于0.05，故沒有統計學意義。

線性回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關性系數表第六列的顯著性系數（P值）均大于0.05，故沒有統計學意義。

3 討論

本研究是以武漢市社區成年人為研究對象，通過問卷調查、健康體檢和實驗室指標，檢測其血DDT檢出水平可反映普通市民暴露背景DDT的水平。血中DDT的含量集中在一個很小的范圍內，整體值偏小。這與我國 1983年后禁用 DDT有很大的關系，但由于DDT 在土壤中的半衰期從幾年到十幾年不等，故仍可在土壤和農產品中檢測到 DDT 的殘留[1]。本次用到的數據是基線數據，有理由相信后續隨訪中血 DDT 的含量會更低。本次數據的研究對象都居住在武漢的同一個小區，居民飲食的來源地比較局限，這也是DDT 含量集中在一個很小范圍的原因之一。而尿中 8-OHdG 的分布呈右正偏態，這與機體的氧化反應與抗氧化反應水平的相關，符合先前報道中的分布情況[2]。本研究表明，在不同性別中，血中 DDT 和尿8-OHdG 的分布差異無統計學意義。當然，影響尿中 8-OHdG 的因素有很多，諸如飲食習慣、吸煙、飲酒、年齡等，在后續的研究中可以將多種影響因素引入，分類變量以百分比表示，以 Chi-square 檢驗比較各組間的差異;連續型變量以平均值（標準偏差）表示，用t檢驗比較各組之間的差異。分析比較了不同性別血中DDT殘留量的差異，結果無統計學意義。發現血中pp’-DDT與糖脂代謝水平有顯著性關聯。由于建模的失敗，導致中介效應分析的探究失敗。已有文章闡釋了8-OHdG與糖尿病的關聯[3]，暫不能排除氧化性損傷在DDT對糖脂代謝影響中的中介作用。后續研究中可以在自變量（DDT）與中介變量（8-OHdG）建模成功后再分析氧化性損傷在其中發揮的作用。DDT對多種器官和系統有明顯的毒性作用，有報道顯示，DDT可引起明顯的肝臟損傷[4]，而肝臟是進行氧化與抗氧化反應和物質代謝的重要場所，與糖脂代謝關系密切。故值得進一步探討氧化損傷在其中發揮的作用。

下一步的研究思路：加入混雜因素進行分析，如：年齡、性別、飲食習慣、飲酒、鍛煉等，分析這些混雜因素在男女性別中的分布差異，并進行卡方檢驗;探究血DDT和尿8-OHdG是否符合二元logistic回歸，并將混雜因素加入回歸模型進行校正;探究氧化損傷在血pp’-DDT與尿8-OHdG的關聯關系中的作用。

參考文獻：

[1]金士威，黎明，廖濤，惠陽，徐盈.武漢市郊農田土壤中有機氯農藥的殘留分析[J].武漢工程大學學報，2009，31（07）：1-3+22.

[2]肖麗麗.社區人群鎘暴露與2型糖尿病的關聯性研究及其相關機制探討[D].華中科技大學，2019.

[3]高瑞霄，姚朱華，馮憑，唐亮.糖尿病患者尿8-OHdG水平變化及其與糖脂代謝指標的相關性[J].山東醫藥，2014，54（30）：76-77.

[4]趙苒，郭向宇，王娟，蘇艷華，鄭芳，范春.苯并（a）芘和滴滴涕聯合暴露對小鼠肝臟細胞凋亡的影響[J].癌變·畸變·突變，2011，23（03）：194-198.

作者簡介：

劉亞航（1998.9—），女，黑龍江省齊齊哈爾市人，湖北省武漢市華中科技大學同濟醫學院，預防醫學專業，本科生。

徐曉凡（1999.11—），安徽省合肥市人，湖北省武漢市華中科技大學同濟醫學院，預防醫學專業，本科生。

趙慧（1999.12—），河北省邯鄲人，湖北省武漢市華中科技大學同濟醫學院。預防醫學專業。本科生。