芪莧降糖方對2型糖尿病模型小鼠降血糖的機制研究※

范曉利 吳 侃 謝 敏 康 璇

(南京醫科大學附屬江寧醫院內分泌科，江蘇 南京 210000)

糖尿病是由多種病因引起的，以慢性高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病，近年來隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，我國糖尿病的發病率呈快速上升趨勢[1-2]。目前，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管病變之后的第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病，據世界衛生組織(WHO)以及國際糖尿病聯盟的資料顯示，預計到2025年全球的糖尿病患者將達到3.3億[3-5]。西醫對于糖尿病主要以降血糖對癥治療，但用藥不當多易發生藥物性低血糖反應，長期用藥還易產生耐藥性，且醫療費用昂貴[6-8]。中醫藥治療糖尿病正逐漸成為研究熱點，中藥具有多靶點、多環節、多途徑的治療特點，且隨著中醫藥現代化研究進程的加快，國內外學者對抗糖尿病中藥復方的研究也愈加關注[9-11]。芪莧降糖方是我科治療2型糖尿病的經驗方，我們擬通過四氧嘧啶建立2型糖尿病小鼠模型，觀察其對小鼠的治療作用，探索芪莧降糖方的降血糖作用機制，為其進一步的臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，標準體質量(200±2)g，普通飼料喂養，自由飲水和進食，光照12 h，室溫(24±2)℃，相對濕度45%～60%，均購自江蘇大學，動物合格證號：201805773。

1.2 主要藥物 芪莧降糖方(主要由黃芪、馬齒莧、山藥、葛根、知母、麥冬等組成，由我院自主研制顆粒劑)；鹽酸二甲雙胍腸溶片(北京京豐制藥集團有限公司，國藥準字H20123202)；四氧嘧啶(美國Sigma公司)。

1.3 主要試劑及儀器 小鼠肝糖原酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒、小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠甘油三酯(TG)ELISA試劑盒、小鼠總膽固醇(TC)ELISA試劑盒、小鼠高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)ELISA試劑盒、小鼠低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)ELISA試劑盒、小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒、小鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)ELISA試劑盒及小鼠丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；鼠抗鼠Bax單克隆抗體與兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體及其相關免疫組化試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；BioTek Epoch全波長酶標儀(上海普迪生物技術有限公司)；快速血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；德國賀利氏Heraeus冷凍離心機(北京創世云博科技發展有限公司)；尼康正置熒光顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型的建立 所有小鼠適應性喂養3 d后，禁食不禁水12 h，隨機取10只小鼠作為空白對照組，其余50只小鼠一次性予0.075 g/kg四氧嘧啶溶液尾靜脈注射，構建2型糖尿病小鼠模型[12]。造模小鼠正常喂養1周后，禁食不禁水12 h，尾尖靜脈取血測定空腹血糖(FPG)值，>11.1 mmol/L即為造模成功。

1.4.2 分組及給藥 將造模成功的50只小鼠隨機分為模型組、陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組、芪莧降糖方中劑量組及芪莧降糖方高劑量組。模型組和空白對照組小鼠予蒸餾水0.4 mL/200 g灌胃，陽性對照組予鹽酸二甲雙胍0.15 g/kg溶液灌胃，芪莧降糖方高、中、低劑量組分別予芪莧降糖方顆粒混懸液3、2、1 g/kg灌胃，均每日灌胃1次，連續灌胃14 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 FPG檢測 各組小鼠分別在灌胃前及灌胃14 d后進行FPG水平的測定。禁食不禁水12 h后通過尾尖靜脈取血，快速血糖儀測定其FPG水平。

1.5.2 血清胰島素、氧化應激及血脂指標檢測 各組小鼠在末次給藥后，禁食12 h，摘眼球取血，將血液收集于離心管中，37 ℃水浴20 min后，以3 700 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法對各組小鼠血清胰島素、氧化應激指標(包括SOD、GSH-Px及MDA)及血脂指標(包括TG、TC、HDL-C及LDL-C)水平進行檢測，嚴格按試劑盒說明操作。

1.5.3 肝臟組織檢測

1.5.3.1 病理切片觀察 各組小鼠取血完畢后采用頸椎脫臼法處死，摘取肝臟。取適量肝臟組織，用0.9%氯化鈉注射液清洗干凈，在5%的甲醛溶液中固定后，固體石蠟包埋，切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法對肝臟組織切片染色，并于顯微鏡下觀察。

1.5.3.2 肝糖原含量測定 各組小鼠取適量肝臟組織，用0.9%氯化鈉注射液清洗干凈，并用濾紙吸干水分后稱取肝組織質量，在冰浴條件下加10倍體積的0.9%氯化鈉注射液，制成0.1 g/mL組織勻漿液，以3 700 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法對肝臟組織肝糖原含量進行檢測，嚴格按試劑盒說明操作。

1.5.3.3 Bcl-2及Bax蛋白的表達 各組小鼠取適量肝臟組織，在5%的甲醛溶液中固定后，固體石蠟包埋，切片，然后采用免疫組化染色法進行染色，嚴格按試劑盒說明操作，然后在顯微鏡下觀察Bcl-2及Bax蛋白的表達情況。

2 結 果

2.1 各組小鼠灌胃前后FPG水平比較 見表1。

表1 各組小鼠灌胃前后FPG水平比較

由表1可見，與空白對照組灌胃前比較，模型組、陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組、芪莧降糖方中劑量組及芪莧降糖方低劑量組FPG水平均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示造模成功。與模型組灌胃14 d后比較，陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組FPG水平均下降，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組FPG水平雖也有下降趨勢但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與陽性對照組灌胃14 d后比較，芪莧降糖方高、中劑量組FPG水平與其比較差異均無統計學意義(P>0.05)，芪莧降糖方低劑量組FPG水平則高于陽性對照組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠灌胃14 d后血清胰島素水平比較 見表2。

由表2可見，與空白對照組比較，模型組小鼠灌胃14 d后血清胰島素水平下降，比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組灌胃14 d后血清胰島素水平均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組血清胰島素水平雖也有升高趨勢但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，芪莧降糖方高、中劑量組灌胃14 d后血清胰島素水平均升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)，但芪莧降糖方低劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠灌胃14 d后血清胰島素水平比較

2.3 各組小鼠灌胃14 d后血清SOD、GSH-Px及MDA水平比較 見表3。

表3 各組小鼠灌胃14 d后血清SOD、GSH-Px及MDA水平比較

由表3可見，與空白對照組比較，模型組小鼠灌胃14 d后血清SOD及GSH-Px水平下降，MDA水平升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組灌胃14 d后血清SOD及GSH-Px水平均升高，MDA水平均下降，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組血清SOD、GSH-Px及MDA水平雖有改善但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，芪莧降糖方高劑量組血清SOD、GSH-Px及MDA水平改善幅度優于陽性對照組(P<0.05)，芪莧降糖方中劑量組與陽性對照組相當(P>0.05)，芪莧降糖方低劑量組不及陽性對照組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠灌胃14 d后血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較 見表4。

表4 各組小鼠灌胃14 d后血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較

由表4可見，與空白對照組比較，模型組小鼠灌胃14 d后血清HDL-C水平下降，TG、TC及LDL-C水平升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組灌胃14 d后血清HDL-C水平均升高，TG、TC及LDL-C水平均下降，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平雖也有改善但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，芪莧降糖方高、中劑量組血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平水平改善幅度與陽性對照組相當(P>0.05)，芪莧降糖方低劑量組不及陽性對照組(P<0.05)。

2.5 各組小鼠灌胃14 d后肝臟組織肝糖原含量比較 見表5。

表5 各組小鼠灌胃14 d后肝臟組織肝糖原含量比較

由表5可見，與空白對照組比較，模型組小鼠灌胃14 d后肝臟組織肝糖原含量下降，比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組灌胃14 d后肝臟組織肝糖原含量均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組肝臟組織肝糖原含量雖也有升高趨勢但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，芪莧降糖方高、中劑量組灌胃14 d后肝臟組織肝糖原含量與其比較差異均無統計學意義(P>0.05)，芪莧降糖方低劑量組肝臟組織肝糖原含量則低于陽性對照組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6 各組小鼠肝臟組織病理形態學觀察 空白對照組小鼠肝細胞呈多邊形，核大而圓，位于肝細胞中央，細胞排列有序。模型組小鼠肝細胞腫脹變形，肝細胞呈多核狀態，細胞膜破壞，部分肝細胞破裂，出現明顯炎癥細胞浸潤。陽性對照組小鼠可見炎癥細胞浸潤狀況較少，細胞腫脹度比模型組輕，細胞結構較完整。芪莧降糖方高劑量組肝組織表現與陽性對照組相似。芪莧降糖方中、低劑量組炎性細胞浸潤與細胞腫脹度均比模型組輕，且細胞結構完整。見后插1，圖1。

2.7 各組小鼠肝臟組織Bcl-2及Bax蛋白表達 空白對照組小鼠肝臟組織Bcl-2蛋白表達量較高，Bax蛋白表達量很低，而模型組小鼠Bcl-2蛋白表達量很低，Bax蛋白表達量很高。陽性對照組及芪莧降糖方高劑量小鼠肝臟組織Bcl-2蛋白表達量較模型組明顯增加，Bax蛋白表達量明顯降低。芪莧降糖方中、低劑量Bcl-2蛋白表達量也較模型組增加，Bax蛋白表達量降低。見后插1，圖2；后插2，圖3。

3 討 論

2型糖尿病是由于先天的遺傳因素和后天的各種環境因素共同作用而形成的一種慢性疾病，是由于體內相對或者絕對缺乏胰島素，或靶細胞對胰島素敏感性減低，或胰島素本身存在一些結構上的缺陷，從而導致以糖代謝紊亂為主，并常合并有蛋白質及脂肪代謝紊亂的一種疾病，同時還可導致機體氧化應激反應增強，從而引起其他的并發癥[13]。二甲雙胍是臨床上治療2型糖尿病的常用藥物，其可增強胰島素的敏感性，增加胰島素與其受體結合，并抑制胰高血糖素的釋放，從而促進細胞對葡萄糖的無氧酵解，抑制組織的呼吸，以及肝糖原的異生，使得葡萄糖的來源減少，增強組織對葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖[14-16]。本實驗結果顯示，灌胃前模型組、陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組、芪莧降糖方中劑量組及芪莧降糖方低劑量組FPG水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)，提示造模成功，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組經過相應藥物灌胃干預后FPG水平較模型組均有明顯下降(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組僅有下降趨勢(P>0.05)，說明芪莧降糖方有確切的降糖效果，芪莧降糖方高、中劑量的降糖效果與鹽酸二甲雙胍相當(P>0.05)，具有一定的劑量依賴性。

在2型糖尿病發展的過程中，胰島素分泌水平的降低是導致血糖升高并最終發展成為糖尿病的重要原因之一，因此通過刺激胰島素分泌，增加其在體內的含量，以降低血糖水平，緩解臨床癥狀，一直都是臨床治療糖尿病的重要途徑之一，眾多研究也將藥物增加體內胰島素分泌的效果作為評價其降血糖活性的重要指標[17-18]。本實驗結果顯示，模型組血清胰島素水平明顯低于空白對照組(P<0.05)，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組經相應藥物灌胃干預后血清胰島素水平較模型組均明顯升高(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組僅有升高趨勢(P>0.05)，說明芪莧降糖方能夠有效增加胰島素分泌水平，且芪莧降糖方高、中劑量增加胰島素分泌的作用優于鹽酸二甲雙胍(P<0.05)。

研究表明，長期的高血糖狀態會導致機體氧化應激系統異常以及脂質過氧化，而氧化應激反應又會進一步加劇糖尿病的病情，并會導致相應的并發癥[19]。過高的氧化應激反應使細胞膜上生成大量具有毒性的脂質過氧化物MDA，進而對胰島β細胞的功能造成不同程度的損傷[20]。另外，SOD、GSH-Px等內源性抗氧化物酶體系可通過清除體內過多的自由基，降低有害自由基在機體內的堆積，防止氧化應激反應對機體組織造成損傷，具有一定的保護作用[21-22]。本實驗結果顯示，模型組小鼠較空白對照組血清SOD及GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)，說明小鼠體內氧化應激反應增強，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組經相應藥物灌胃后血清SOD及GSH-Px水平較模型組均明顯升高(P<0.05)，MDA水平均明顯降低(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組對血清SOD、GSH-Px及MDA水平無明顯改善(P>0.05)，說明芪莧降糖方可降低MDA水平，增加SOD、GSH-Px水平，提高小鼠抗氧化能力，且芪莧降糖方高劑量的效果優于鹽酸二甲雙胍(P<0.05)。

血脂代謝紊亂也是2型糖尿病的主要特征，由于胰島素分泌不足，脂肪組織攝取葡萄糖及清除TG和脂肪酸的能力下降，脂肪合成代謝減弱，脂蛋白脂酶活性低下，血中游離脂肪酸和TG濃度增高，另外在胰島素極度缺乏時，激素敏感性脂酶活性增強，體內脂肪的動員和分解加速，TC水平更高[23]。HDL-C主要作用是將膽固醇運送到肝臟進行分解代謝并排出體外，LDL-C則是運輸內源性膽固醇的主要載體，血脂代謝異常對兩者的水平也會發生明顯變化[24]。本實驗結果顯示，模型組較空白對照組血清HDL-C水平明顯下降(P<0.05)，TG、TC及LDL-C水平明顯升高(P<0.05)，說明小鼠出現血脂代謝紊亂，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組經相應藥物灌胃后血清HDL-C水平較模型組明顯升高(P<0.05)，TG、TC及LDL-C水平均明顯降低(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組對血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平無明顯改善(P>0.05)，說明芪莧降糖方可降低TG、TC及LDL-C水平，提高HDL-C水平，改善血脂代謝紊亂，且芪莧降糖方高、中劑量的改善效果與鹽酸二甲雙胍相當(P>0.05)。

葡萄糖在體內被攝取后，通過胰島素作用合成為肝糖原并儲存在肝臟中，這也是葡萄糖在體內的重要儲存形式，但其合成量受胰島素分泌狀況影響。肝糖原合成量減少可導致血糖水平升高，研究證明肝糖原合成量的減少與糖尿病的形成有關，并已有研究者將肝糖原合成量增加作為衡量藥物降血糖活性的重要指標[25-26]。本實驗結果顯示，模型組小鼠肝臟組織肝糖原含量較空白對照組明顯下降(P<0.05)，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組及芪莧降糖方中劑量組經相應藥物灌胃后肝臟組織肝糖原含量較模型組明顯升高(P<0.05)，芪莧降糖方低劑量組僅有升高趨勢(P>0.05)，說明芪莧降糖方可促進肝糖原的合成，進而降低血糖水平，且芪莧降糖方高、中劑量的改善效果與鹽酸二甲雙胍相當(P>0.05)。

Bcl-2基因家族在細胞凋亡調控中具有重要作用,其可分為抑制凋亡和促進凋亡兩大類，Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡蛋白和促進凋亡蛋白。研究發現Bax與Bcl-2兩者之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵[27]。肝臟在葡萄糖代謝和能量穩態中起重要作用,其是胰島素作用及其攝取和降解的主要器官，肝功能受損與糖尿病之間也有密切關系[28]。本實驗結果顯示，模型組小鼠肝細胞腫脹變形，細胞膜破壞，出現明顯炎癥細胞浸潤，Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，說明糖尿病的發生過程中有肝細胞凋亡的發生，而陽性對照組、芪莧降糖方高劑量組、芪莧降糖方中劑量組及芪莧降糖方低劑量組經相應藥物灌胃治療后，肝臟炎癥細胞浸潤及細胞腫脹度均比模型組輕，肝細胞的損傷情況得到一定改善，Bax蛋白表達量均有減少，Bcl-2蛋白表達量均有增加，從而抑制了糖尿病所引起的肝細胞凋亡，恢復肝臟在代謝中的功能。說明芪莧降糖方對肝細胞具有保護作用，減輕糖尿病對肝臟的破壞。

綜上所述，芪莧降糖方對2型糖尿病小鼠具有確切的治療作用，可明顯降低2型糖尿病模型小鼠血糖水平，其作用機制可能與促進胰島素表達、抑制氧化應激反應、糾正血脂代謝紊亂、促進肝糖原合成、減少肝細胞凋亡有關，并具有一定的劑量依賴性，高劑量水平效果更好。