利用滑石粉作為甜玉米花粉增量劑的貯藏技術分析及應用

龍譽銘 夏州藩 趙竑博

摘要：【目的】利用滑石粉作為增量劑稀釋甜玉米花粉，對比離體花粉在不同稀釋比例、不同溫度和不同貯藏時間條件下的儲藏效果，為提高玉米育種和制種產量及降低減產風險提供參考依據。【方法】以金卡HM608甜玉米的父本花粉為試驗材料，用滑石粉作為玉米花粉的增量劑，共設3個（按質量分數）增量劑填充處理（10%、30%、100%），4個時間處理（1、3、5和7 d），5個溫度處理（-5、5、10、15和25 ℃），以不添加增量劑的花粉作為對照，結合田間測定法及氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法，探討在不同增量劑比例、不同處理溫度及處理時間下離體甜玉米花粉的TIC染色率和田間結實率。【結果】當處理溫度為-5、5和10 ℃時，貯藏1 d的花粉田間結實率在82.26%以上;貯藏5 d后，無增量劑花粉的T TC染色率及田間結實率顯著下降，平均為25.24%和13.68%;添加10%和30%增量劑的花粉，貯藏5 d仍然有61.22%以上的田間結實率;當增量劑比例在100%且貯藏為5 d時，田間平均結實率為7.19%，當處理溫度為15和25 ℃時，田間結實率為0，反映出增量劑比例和溫度過高均不利于花粉的保存，增量劑越多或持續時間越長對花粉活力傷害越大。不同增量劑填充處理的花粉活性及田間結實率均隨著處理溫度上升和貯藏時間延長而降低。【結論】保存溫度在-5～10 ℃，添加10%和30%滑石粉作為甜玉米花粉增量劑能有效延長花粉生活力，該貯藏技術操作簡單易行，對于指導授粉工作、減少制種風險、提高制種產量具有現實意義。

關鍵詞： 甜玉米;花粉活力;滑石粉;增量劑;貯藏技術

中圖分類號： S513? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1669-08

Abstract：【Objective】Using talcum powder as increment agent to dilute sweet corn pollen，the storage effect of in vitro pollen under different dilution ratios，different temperatures and different storage times was compared，which provided reference for improving maize breeding and seed production yield and reducing the risk of reduction. 【Method】With Gold Card HM608 male parent of maize pollen as research materials，taking talcum powder as the increment agent of corn po-llen， set up three（by mass fraction）incremental doses of filling processing（10%， 30% and 100%），four duration of treatments（1， 3， 5 and 7 d）and five different processing temperatures（-5， 5， 10， 15 and 25 ℃）. The pollen without adding increment agent was set as the control. Field assay and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining were both used to investigate the TTC staining rate and seed setting rate of sweet corn pollen in vitro at different proportional increment agents，treatment temperatures and treatment times. 【Result】When the storage temperature was -5， 5 and 10 ℃，the field seed setting rate of pollen stored for 1 d was above 82.26%. After 5 d of storage，the TTC staining rate and field setting rate of pollens without increment decreased significantly，averaging 25.24% and 13.68%. After adding 10% and 30% increment to pollen，the field setting rate was still over 61.22% after 5 d storage. When the proportion of increment agent was 100% and the storage time was 5 d， the average field setting rate was 7.19%;when the storage temperature was 15 and 25 ℃，the field setting rate was 0，reflecting that both the proportion of increment agent and the temperature were too high，and the more increment agent or the longer the duration，the greater the harm to pollen viability. Under different increment agent treatments， the pollen activity and field setting rate decreased with the increase of treatment temperature and storage time. 【Conclusion】According to the comprehensive analysis，the storage temperature of -5-10 ℃，and the addition of 10% or 30% talcum powder as sweet corn pollen increment agent can effectively prolong pollen viability. This storage technology is easy to operate，and has practical significance for guiding pollination，reducing seed production risk and increasing seed production yield.

Key words： sweet corn; pollen viability; talcum powder; incremental agent; storage technology

Foundation item： National Vegetable Industry Technology System Project of China（CARS-23-G-49）; International Science and Technology Cooperation and Innovation Platform Project of Higher Education of Guangdong（GJHZ1140）

0 引言

【研究意義】甜玉米花粉是甜玉米的雄性器官，包含甜玉米的所有基因類型，是甜玉米種質保存、交換及雜交育種的重要材料（張亞利等，2006;Lee et al.，2014）。近年來，甜玉米在南方地區制種面積不斷擴大，由于高溫高濕氣候影響，許多甜玉米花粉的壽命非常短，在常溫下只能維持幾小時就糖化結塊，喪失活力。滑石粉以其疏水抗黏、分散性好、柔軟、耐高溫等優良的理化特性，再加上價格低廉、容易購買的特點，已成為育種企業和農戶首選的花粉填充材料，并被廣泛應用于甜玉米授粉作業中。在實際生產中，當氣溫高于32～35 ℃、空氣濕度達30%以上，會使玉米抽雄提前，雌穗吐絲延遲，造成雌雄不調（任轉灘等，2008），還會使花粉發育不正常或敗育，導致花粉數量減少、生活力減弱，甚至完全喪失受精能力（楊國虎，2005）。研究表明，玉米自交系在不同地區及氣候環境影響下，父母本花粉和花絲變化敏感程度不同（鄭飛等，2015），通常會造成花期不遇，在母本發育過遲的情況下，如能及時采集父本花粉并保存3～5 d，待母本吐絲后，避開高溫及雨水的影響，選擇相對適宜的時段及時人工授粉，可有效補救或挽回經濟損失。因此，深入探討滑石粉作為甜玉米花粉增量劑的保存技術對于減少制種風險、提高制種產量及完善甜玉米種質資源保存方法具有重要意義。【前人研究進展】利用滑石粉作為花粉的增量劑已有文獻報道。20世紀80年代，我國贈送日本“禾華松”馬尾松樹苗時，就用滑石粉作為增量劑稀釋馬尾松父本花粉（宋志強和朱勇，2007）;Cristián等（2008）利用滑石粉稀釋核桃花粉，再通過人工授粉的方法，研究核桃花粉過量或缺乏引起的核桃花敗育癥狀，探討核桃花敗育與核桃花梗發育的關系。此外，為延長玉米花粉生活力，前人對玉米花粉的保存方法也進行了相關研究。侯有良等（2001）研究表明，3個玉米自交系的花粉在常溫下避光保存26 h后，只有1.2%～3.4%的田間結實率。張紅梅等（2005）研究離體玉米花粉在不同溫度條件下的生活力，結果顯示，離體玉米花粉生活力保持在90%以上的儲存條件是：24 ℃保存8 h，4 ℃保存32 h，-20 ℃保存56 h。亓文儉等（2009）研究發現，不同玉米自交系的花粉其生命活性不同，在田間自然過夜條件下（22～30 ℃），花粉粒的壽命在24～48 h。王霞等（2013）以不同類型玉米自交系為材料，田間采集花粉并在室內不同溫度條件下保存一定時間，然后進行田間授粉，結果發現，在4 ℃條件下，貯藏5 d的花粉平均田間結實率為30%。宋方威等（2014）研究發現，玉米花粉在25 ℃室溫條件下，8 h后基本喪失活力。以上研究結果揭示了溫度和貯藏時間是影響玉米花粉生活力的重要因素，離體玉米花粉貯藏3～5 d后田間結實率已很低，不適合應用于實際生產。【本研究切入點】前人研究結果證實低溫條件可顯著延長玉米花粉的生活力，可使玉米花粉的壽命從幾小時延長至幾年，并能保持其品種的遺傳穩定性（王艷哲等，2008），但以往研究主要側重純花粉低溫貯藏技術或田間自然條件下花粉生活力的分析探索，而利用滑石粉作為甜玉米花粉增量劑的低溫貯藏技術卻鮮見報道，且以往研究成果只停留在實驗室層面，在實際生產中并不適用，有些研究成果雖實用，但其對技術及設備的要求過高，很多生產企業難以實施。【擬解決的關鍵問題】以金卡HM608父本花粉為試驗材料，在室內常溫和低溫條件下利用滑石粉作為增量劑稀釋甜玉米花粉，對比離體花粉在不同稀釋比例、不同溫度和不同貯藏時間條件下的儲藏效果，采取氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法和田間授粉法，測定TTC染色率和田間結實率，綜合分析不同條件對甜玉米花粉活力和結實率的影響，以期獲取簡單易行、操作方便的花粉保存方法，為提高玉米育種和制種產量及降低減產風險提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗于2018年8—12月在廣東省韶關市仁化縣玉米制種基地進行，試驗地位于東經113°28′、北緯251°13′，海拔高度100 m，屬亞熱帶季風氣候，冬春冷、夏秋熱，年均氣溫19.6 ℃;4—9月降水量占全年降水量的70%，年平均降水量1648.3 mm;無霜期297 d。

1. 2 試驗材料

玉米花粉來自廣西金卡農業科技有限公司提供的金卡HM608甜玉米品種，取自大田生長盛花期的父本花粉。滑石粉為普通醫用級滑石粉。

主要儀器設備：304不銹鋼60目標準分樣篩、超凈工作臺，冰箱，冷凍干燥機（上海喬躍，FD-1B-80），5 mL連蓋圓底離心管，光學顯微鏡，載玻片，培養皿和電子分析天平。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 試驗設計 選擇地勢平整，前茬一致，肥力中上，排灌方便，四周無蔭蔽的田塊。種植密度為 45000株/ha，按長600 cm、寬150 cm（包括排灌溝）的標準進行雙行定植，株距30 cm、行距60 cm，每畦種植40株，母本種植9個重復，合計360株，保苗320株。為方便試驗，父本按照溫度及時間處理劃分4個小區種植，每期播種50株，合計200株。根據金卡HM608父母本錯期特點（表1），母本8月1日播種，父本播種日期分別是8月1日、8月3日、8月5日和8月8日，做好標記，進入玉米雄穗盛花期后采粉處理。處理后首先測定花粉TTC染色率，同時進行田間人工授粉。田間授粉時間選擇上午10：00以后，所用雌穗均處于吐絲后的第3和4 d，正值花絲生活力旺盛階段，各處理雌穗的發育進程基本相同。為保證授粉的均勻一致，授粉前先剪短母本花絲，只留2～3 cm。每處理授粉4株，以當天采粉后立即授粉且不添加增量劑的花粉作為對照，授粉后用羊皮紙袋套好，大頭針固定并做標記。待玉米成熟后，11月12日調查果穗結實情況，以結實率反映玉米花粉活力。結實率（%）=（各處理單穗結實粒數/對照平均單穗結實粒數）×100 。

1. 3. 2 花粉的取粉方法 在盛花期選擇晴天，取粉的時間一般從上午10：00開始（大霧天氣可選擇11：00以后）。為方便取粉，先把靠近玉米雄穗的2片葉子剪掉，左手拿住取粉袋，右手把玉米雄穗傾斜置于采粉袋的喇叭口內，輕輕搖動，花粉即落入袋內。

1. 3. 3 篩粉及混合增量劑方法 所采的花粉里混有大量的花藥，花藥含水量較高，如不及時處理，花粉就會受潮黏合影響試驗結果，因此花粉和增量劑（滑石粉）混合最好在取粉后90 min內完成。具體方法：篩粉前，在干燥平坦的地方鋪一張質硬干凈的白紙，把采集的花粉倒入60目標準分樣篩里，來回搖動篩子，使花粉均勻地篩灑在紙上。然后把花粉與預定比例的增量劑（滑石粉）混合后重復過篩3次，使花粉增量劑與花粉攪拌均勻，將混合好的花粉均勻分散地平鋪在紙上，放置在干燥通風的地方待用，盡量不要堆放。

1. 3. 4 花粉貯藏方法 將通過以上方法處理后的花粉，按10%、30%、100%的滑石粉填充劑比例進行稀釋，以不添加增量劑的花粉作為對照。每個稀釋比例5個重復，分別置于5 mL圓底離心管中，蓋上離心管蓋，再用保鮮膜密封。設置-5、5、10、15和25 ℃共5個溫度梯度，使用冰箱設置-5和5 ℃貯藏，使用冷凍干燥機設置10、15和25 ℃貯藏，貯藏時間分別為1、3、5和7 d。

1. 3. 5 花粉活力室內測定方法 在離體花粉進行相關處理后，采取TTC法測定TTC染色率。具體方法：用0.5%氯化三苯基四氯唑溶液與適量花粉均勻混合做成切片，放在37 ℃的烘箱中，30 min后放置于光學顯微鏡下觀察，目鏡放大倍數為10×，物鏡放大倍數為10×，凡被染為紅色的為強活力花粉;淡紅色的次之;無色則為無活力花粉（高俊鳳，2000）。每個處理觀察2張玻片，每玻片取4個視野，即每個處理共觀察8個視野，要求每個視野花粉粒數≥20，統計花粉的平均染色率（以染色率代表花粉活力）。染色率（%）=（每個視野花粉染色粒數/每個視野花粉粒總數）×100。

1. 4 統計分析

利用 Excel 2010和 SPSS 18.0對相關數據進行非參數檢驗及方差分析，使用SPSS 18.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 不同增量劑條件下，處理溫度及貯藏時間對TTC染色率及田間結實率的影響

由圖1～圖4可看出，不同溫度處理脅迫下花粉活力喪失是一個連續變化的過程。處理溫度為-5、5、10 ℃時，添加不同比例增量劑的花粉貯藏1 d，TTC染色率在85.17%以上，田間結實率在82.26%以上，均高于其余貯藏時間處理。處理溫度為-5和5 ℃時，無增量劑（圖1）及100%增量劑（圖4）的花粉貯藏3 d，花粉TTC染色率平均為70.81%，田間結實率平均為60.25%，當處理溫度超過10 ℃時，花粉活力隨溫度的升高、貯藏時間的延長迅速降低，當處理溫度為15 ℃時，田間結實率迅速下降到15.00%以下。處理溫度為-5～10 ℃、貯藏時間為1和3 d時，10%增量劑（圖2）和30%增量劑（圖3）的花粉活力及田間結實率較高，TTC染色率在93.37%以上，結實率在82.65%以上。可見，在相同的處理條件下，添加10%和30%增量劑的花粉TTC染色率及田間結實率明顯高于無增量劑的花粉。

2.2 不同貯藏時間下，增量劑與溫度互作對TTC染色率及田間結實率的影響

2. 2. 1 TTC染色率 從表2可知，無增量劑、處理溫度為-5、5和10 ℃的玉米花粉，貯藏1 d內TTC染色率無顯著變化（P>0.05，下同），平均為96.74%，貯藏3 d后活力顯著下降（P<0.05，下同），平均為68.59%，貯藏5 d后，平均為25.24%;10%增量劑、處理溫度為5和10 ℃的玉米花粉，貯藏1 d的TTC染色率平均為95.78%，貯藏3 d平均為95.66%，貯藏5 d后活力有所下降，但仍然有81.35%以上的TTC染色率，而處理溫度為15和25 ℃的玉米花粉貯藏1 d后活力顯著下降，TTC染色率平均為78.49%，貯藏3 d平均只有29.03%。可見，花粉活力隨溫度的增加及貯藏時間的延長而下降，溫度越高，花粉活力隨貯藏時間延長下降越快，越不耐貯藏。30%增量劑條件下玉米花粉活力變化規律與10%增量劑相同，TTC染色測定的花粉染色率與田間結實率指標表現基本一致，與無增量劑及100%增量劑相比，10%和30%增量劑的花粉活力在貯藏過程中出現下降時間更晚，下降速度更慢。說明在相同的貯藏條件下，10%和30%增量劑的花粉比無增量劑及100%增量劑的花粉更耐貯藏。

2. 2. 2 田間結實率 由表3可知，在相同的處理條件下，金卡HM608田間結實率變化規律與其父本花粉活力變化相似，處理溫度為-5、5和10 ℃的玉米花粉，無增量劑時，貯藏1 d，田間結實率無顯著變化，平均為91.27%;貯藏3 d，田間結實率顯著下降，平均為60.57%;貯藏5 d，田間結實率平均只有13.68%;而添加10%和30%增量劑的花粉，貯藏5 d的田間結實率在61.22%以上;當增量劑比例為100%且貯藏5 d時，田間平均結實率僅為7.19%，當處理溫度為15～25 ℃時，田間結實率為0。由此可見，在相同的處理條件下，10%～30%增量劑的花粉較無增量劑及100%增量劑的花粉田間結實率更高。

從表2和表3還可看出，當TTC染色率低于10% 時，田間結實率基本為0，處理溫度大于10 ℃且增量劑比例大于30% 時，花粉活力隨溫度上升和貯藏時間延長呈下降趨勢，當溫度進一步升高，花粉活力過低并迅速下降至接近0的水平，已失去貯藏意義。

2. 3 不同增量劑比例花粉的TTC染色率與田間結實率的相關分析

從表4相關分析結果來看，不同增量劑比例花粉的TTC染色率與甜玉米的田間結實率均呈正相關關系，相關系數為0.980～0.990，相關性均達極顯著水平（P<0.01），說明花粉的TTC染色率越高，其田間結實率就越高。

3 討論

滑石粉是一種白色柔軟的疏水性物質，屬天然的單斜晶系水合硅酸鹽，由31.7%的氧化鎂、63.5%的二氧化硅及4.8%的水組成，化學穩定性良好，流動性好，具有潤滑、抗黏、助流、耐高溫等優良特性（殷代武和譚卉文，2013）。滑石粉由于其分散性能好，可有效阻擋花粉粒之間相互聚集，疏水抗黏，防止糖化結塊，最早被利用摻在花粉中的主要目的是稀釋雜交育種父本花粉，節省花粉用量。20世紀80年代后期日本曾研制出在比重、顆粒大小、生物學特性等方面與農作物相近的植物孢子“石松子”，經過染色作為花粉增量材料，因其特性優異，被應用于植物人工授粉作業（宋志強和朱勇，2007），但可能由于生產成本過高未能得到廣泛應用。本研究中，利用價格低廉、容易購買的滑石粉作為玉米花粉增量劑，探討離體玉米花粉與滑石粉按不同比例混合后，花粉在不同處理溫度和貯藏時間下的生活力，研究結果發現，利用10%～30%滑石粉作為增量劑，-5～10 ℃溫度貯藏1～3 d，田間結實率保持在82.26%以上，貯藏5 d田間結實率仍保持在61.22%以上。王霞等（2013）研究表明，離體玉米花粉在4 ℃條件下貯藏5 d的平均田間結實率為30%。本研究在添加10%～30%滑石粉增量劑的情況下，田間結實率高于王霞等（2013）的研究結果，表明在常溫或低溫條件下，添加適量滑石粉作為增量劑可大幅提高玉米花粉的生活力和田間結實率。

不同貯藏條件下花粉耐貯藏性不同（趙嬋璞等，2014）。本研究中，添加10%滑石粉增量劑的玉米花粉分別貯藏3和5 d，發現10 ℃處理的田間結實率高于-5和5 ℃處理，可能與空氣濕度和花粉相對含水量有關。處理溫度為-5和5 ℃使用家用冰箱儲存花粉，處理溫度為10 ℃使用干燥箱儲存花粉。研究表明，未經干燥的花粉細胞自由水含量較高，花粉在低溫貯藏過程中易形成細胞內結晶，引起細胞破裂，導致花粉活力降低（常維霞等，2018），從而影響田間結實率，與任轉灘等（2008）、鄭飛等（2015）所得的結論一致，至于玉米花粉保存過程中的干燥時間、干燥強度等對貯藏效果的影響程度，還有待進一步探討。此外，本研究還發現，-5～10 ℃溫度下10%滑石粉增量劑處理的花粉貯藏3 d，田間結實率為91.17%;貯藏5 d的田間結實率為72.28%，均高于30%滑石粉增量劑處理，表明10%滑石粉增量劑處理的儲藏效果優于30%滑石粉增量劑處理，當滑石粉比例在100%且貯藏期為5 d時，田間平均結實率為7.19%，當保存溫度為15～25 ℃時，田間結實率為0，表明增量劑比例和溫度過高均不利于花粉的保存。滑石粉過多會降低花粉活力和田間結實率，其主要原因可能有四方面：第一，滑石粉不含營養成分，不能提供花粉萌發所需的營養元素（碳水化合物）;第二，由于滑石粉吸附力強（李萍等，2013），易包圍整個花粉粒，而且質量較重，容易壓迫花粉粒，造成花粉細胞形態結構異常，使花粉粒畸形，堵塞花粉萌發孔，影響花粉管發育;第三，當滑石粉散落的玉米雌蕊柱頭上時，占據了雌蕊柱頭上的受精點位，使花粉管不能順利進入雌蕊柱頭進行受精，造成精核錯過雌蕊的最佳受精時間，從而影響玉米結實率（逯明輝等，2009）;第四，滑石粉晶體呈假六方或菱形的片狀，容易損傷花粉粒外壁結構，導致生活力減弱，甚至完全喪失受精能力（降志兵等，2016）。

玉米花粉活力主要受兩個因素影響，一是自身遺傳特性，二是外部環境因素影響，如溫度、濕度、貯藏媒介種類、光照強度等（劉芳和周蘊薇，2007;Shtereva et al.，2015）。玉米花粉貯藏技術的研究和應用，一是為保護種質資源，二是克服育種或制種過程中雜交親本的花期不遇問題。例如在海南省玉米父母本錯期為7 d，由于南北氣候的差異，在甘肅省玉米父母本錯期將會超過20 d以上，當未能準確把握父母本錯期時，利用貯藏技術將花粉保存3～5 d，可大大減少制種風險，在實際生產應用中還可減少父本播種批次，增加母本種植面積，從而增加制種產量，降低制種成本。另一方面，廣東地區甜玉米制種授粉時期在9—10月，白天溫度常在30 ℃以上，氣溫高、濕度大，滑石粉以其分散性能好、疏水抗黏、防止糖化結塊的特性，已廣泛應用于甜玉米雜交制種的授粉作業中，只是未對添加滑石粉后玉米花粉的耐貯藏性作深入研究。本研究只針對一個甜玉米自交系材料的花粉進行研究，雖然代表性略顯不足，但仍為研究花粉貯藏方法提供了新思路。

4 結論

保存溫度在-5～10 ℃，添加10%和30%滑石粉作為甜玉米花粉增量劑能有效延長花粉生活力。該貯藏方法簡單實用，要求條件不高，一般在家用電冰箱中即可貯藏，能有效解決雜交親本之間花期不遇，或者遠距離雜交的問題，對于指導授粉工作、減少制種風險、提高制種產量具有現實意義。

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（責任編輯 王 暉）