基于香氣活性值的福建尤溪煙葉提取物香氣特征成分分析

茅中一，洪祖燦，劉加增，周培琛，伊勇濤，操曉亮，張曉兵，謝金棟*

1.福建中煙工業有限責任公司技術中心，福建省廈門市集美區濱水路298號 361021 2.廈門大學化學化工學院化學系，福建省廈門市思明南路422號 361005 3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

福建煙區生態條件適合產出優質煙葉，是典型的清香型煙葉產區［1］。在全國烤煙煙葉香型風格區劃中，福建煙葉風格特征是以干草香、清甜香、蜜甜香為主體，輔以青香、醇甜香、木香、烘焙香、焦香、花香和辛香等［2］，其香氣風格是不同香韻特征的綜合效應，而每種香韻特征的形成均具有復雜的物質基礎。為發揮福建煙葉原料特點，凸顯煙葉香韻風格特征，需要闡明其內在致香成分對香韻特征的貢獻。

關于福建煙葉化學成分的定性分析［3-4］和烤煙煙葉理化指標與煙葉風格特征的相關分析［5-6］已有較多報道，但香氣成分分析結果無法較好地與卷煙感官品質建立關聯。在食品風味分析領域大量研究報道中使用香氣或滋味活性值（Odor/Taste activity value，OAV/TAV）技術將香氣成分分析結果與感官評價建立關聯，從而篩選復雜體系關鍵香氣活性成分、表征香氣風格特征等［7-10］。近年來國內外也先后將OAV/TAV概念引入煙草科學研究領域，例如利用TAV技術分析了煙葉或煙氣中關鍵酸味和甜味物質［11-13］，利用OAV技術研究了卷煙主流煙氣總粒相物中的煙熏香、酸香、清（青）特征成分等［14-17］。而基于OAV分析煙葉提取物致香成分對凸顯煙葉風格特征的研究還鮮有報道，僅近期有文獻報道將OAV技術用于分析不同地區烤煙香氣差異［18］。因此，以福建尤溪煙葉提取物為研究對象，確定了35種主要致香成分并按香韻特征分為7種香韻特征賦予組群，采用內標標準曲線法測定了其在煙葉提取物中的濃度，借鑒食品領域香氣物質在水中的嗅覺閾值，計算了相應的OAV，比較了各香韻特征成分對各香韻特征組群的貢獻度，并利用卷煙加香評吸實驗對結果進行驗證，旨在為加深對福建尤溪煙葉香韻風格及其物質基礎的認識，構建煙葉提取物的致香成分與其香韻風格特征的有效聯系提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

福建尤溪YLC01-2016煙葉由福建中煙工業有限責任公司技術中心提供。

95%乙醇、無水乙醇、二氯甲烷（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；內標：氘代萘、氘代蒽（≥98%，北京百靈威科技有限公司）；標準品：己醛、糠醛、順-3-己烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、麥芽酚（≥95%，北京伊諾凱科技有限公司），2-甲基-3-己酮、2（5H）-呋喃酮、6-甲基-2-庚酮、反，反-2，4-庚二烯醛、甲基環戊烯醇酮、氧化異佛爾酮、反，順-2，6-壬二烯醛（≥95%，日本東京化成工業株式會社），當歸內酯、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、4-乙烯基愈創木酚、香草乙酮［≥97%，阿法埃莎（天津）化學有限公司］，γ-丁內酯、5-甲基糠醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、4-甲基苯乙酮、β-環檸檬醛、苯乙酸乙酯、β-環高檸檬醛、異丁香酚、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內酯（≥95%，北京百靈威科技有限公司），愈創木酚、香蘭素［≥99%，阿拉丁試劑（上海）有限公司］，苯乙醇、β-大馬酮、β-二氫大馬酮（≥95%，美國Sigma-Aldrich公司），β-紫羅蘭酮（≥95%，美國Fluka公司）。

LECO Pegasus BT4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（美國Leco公司）；GFL1041恒溫水浴鍋（德國GFL公司）；Hei-VAP Precision ML旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；AT261變量程電子天平（感量0.000 01 g，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉浸膏制備

取100 g煙葉原料，裝入2 L圓底燒瓶中，加入1 000 g 95%乙醇，水浴80℃提取1 h；濾出第1次提取液后再加入1 000 g 95%乙醇，繼續水浴80℃提取1 h。合并兩次提取所得提取液，體系壓力5～14kPa、水浴溫度50℃下減壓濃縮，控制濃縮液密度在1.37～1.38 g/cm3之間。

1.2.2 分析樣品制備及定性分析條件

取8 g上述所制備的煙葉提取物，加入10 mL含內標物氘代蒽、氘代萘（濃度均為4 μg/mL）的二氯甲烷溶液，充分振蕩20 min，靜置后取上層清液并常溫減壓濃縮（體系壓力20 kPa）至1.5 mL。進行全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用（GC×GC-TOF MS）分析。檢測條件：

色譜柱一：Rtx-5SIL MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱二：Rxi-17SIL MS（1.5 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序；載氣：He，恒流，1.4 mL/min；進樣口溫度：250℃；調制周期：4 s；進樣量：1 μL；進樣模式：分流進樣；分流比：10∶1。離子化方式：EI；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：260℃；EI電離能量：70 eV；溶劑延遲時間：3 min；掃描模式：全掃描；質量掃描范圍：45～450 amu。

采用直接進樣方式進行檢測，利用NIST標準譜圖庫對各色譜峰進行自動檢索。從檢索結果中挑選正向、反向檢索匹配度均大于或等于80%的致香成分。

1.2.3 煙葉提取物各香韻特征成分的定量分析

使用內標法通過標準曲線對煙葉中的各香韻特征成分進行定量分析，分析條件與方法同1.2.2節，以各目標物的濃度與內標物濃度之比為橫坐標，分析物與內標物的峰面積之比為縱坐標建立標準曲線。

1.2.4 致香成分嗅覺閾值的確定和OAV的計算

在化學成分復雜且相互影響的煙葉提取物中，尚未找到合適的體系或介質測定致香成分的嗅覺閾值，本研究中借鑒食品領域中香氣物質在水中的嗅覺閾值來代表其實際的嗅覺閾值［16-17］。致香成分在水中的嗅覺閾值（Olfactory threshold，OT）數據主要來源于文獻［19］，優先使用最新年份的閾值數據［17］；未在文獻中查找到嗅覺閾值的致香成分，依據 GB/T 22366—2008［20］的方法測定其在水中的嗅覺閾值。按照公式（1）計算OAV：

式中：C為致香成分在香氣體系中的質量濃度，μg/mL；OT為致香成分在水中的嗅覺閾值，μg/mL。

1.2.5 煙葉提取物及其香韻特征成分復配物的質量風格特色感官評價

用香精注射機將煙葉提取物和復配物按0.01%的比例均勻添加至參比卷煙中，將得到的樣品煙支置于（22±1）℃和相對濕度（60±2）%的環境中平衡48 h。由福建中煙工業有限責任公司技術中心10名具有省級及以上卷煙感官評價資質的評委參照YC/T 530—2015［21］的方法對參比卷煙和樣品卷煙進行對比評吸。

2 結果與分析

2.1 煙葉提取物致香成分定性分析結果

煙葉提取物的GC×GC-TOF MS定性分析共鑒定出73種揮發性致香成分（表1）。

表1 煙葉提取物致香成分的定性分析結果Tab.1 Results of qualitative analysis of aroma components in tobacco leaf extracts

表1（續）

2.2 煙葉提取物各香韻特征成分的確定

對定性分析出的73種致香成分進行篩選，主要依據是化合物的商品化性（例如反-2-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、茄酮、巨豆三烯酮等未購買到合適標準品，不排除其對香韻特征有重要貢獻）、安全性要求［22-23］等因素，最終篩選出35種香韻特征成分（表2），其香氣特征描述和香韻歸類方式主要參考相關文獻［17，24-25］進行，將35種致香成分按清香、青滋香、花香、果香、焦甜香、豆香和辛香7種香韻進行歸類，其特征成分分別為11、2、6、3、5、4和4種。從表2可知，許多致香成分兼具其他香韻，例如6-甲基-5-庚烯-2-酮兼有清香和果香，以清香為主；麥芽酚兼有焦甜香和果香，以焦甜香為主。

表2 各香韻特征成分的確定及其香氣特征描述Tab.2 Determination of characteristic aroma components and their aroma description

2.3 煙葉提取物各香韻特征成分定量分析

采用內標法對35種致香成分定量測定的線性范圍、回歸方程和相關系數如表3所示，在線性范圍內工作曲線線性相關系數均大于0.998。并采用此方法分別檢測了上述35種香韻特征成分在煙葉提取物中的量。

從表3可知，11種清香特征成分的總量為56.71 μg/mL，其中氧化異佛爾酮未檢出，香葉基丙酮、二氫獼猴桃內酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量較高，其余成分的量均較低；2種青滋香特征成分的總量為0.88 μg/mL，順-3-己烯醛的量大于反，順-2，6-壬二烯醛；3種果香特征成分的總量為3.83 μg/mL，己醛的量最高；6種花香特征成分的總量為23.85 μg/mL，其中苯甲醇和2-乙酰基吡咯的量較高；5種焦甜香特征成分的總量為17.84 μg/mL，2（5H）-呋喃酮和糠醛的量較高；4種辛香特征成分的總量為10.76 μg/mL，4-乙烯基愈創木酚的量最高；5種豆香特征成分的總量為14.48 μg/mL，其中γ-丁內酯和4-甲基苯乙酮的量較高。

實際上，香氣化合物濃度和香氣強度并非簡單的正比關系，還需結合嗅覺閾值得到香氣活性值來綜合考察其對煙葉風格特征的整體貢獻［14-17］。

2.4 煙葉提取物香韻特征成分的貢獻度分析

利用OAV值可從濃度和閾值兩個維度上揭示香氣成分對香氣體系的貢獻度［7］。在食品風味分析中，通常OAV＞1的香氣成分被認為對整體香氣具有一定的貢獻度，其值越大，貢獻度越大。煙葉提取物各香韻特征成分的OAV結果如表4所示。可知，10種清香特征成分中，除反，反-2，4-庚二烯醛外，其余9種成分的OAV均大于1，說明這9種成分對清香香韻均有貢獻。β-大馬酮和β-二氫大馬酮的量之和為0.77 μg/mL，僅占清香特征成分總量的1.37%，但由于其嗅覺閾值最小，所以兩者OAV之和幾乎等于所有清香特征成分OAV之和；而香葉基丙酮、二氫獼猴桃內酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量之和占清香特征成分總量的94.06%，但其嗅覺閾值相對較大，因而OAV較前兩者低。綜合分析，β-大馬酮和β-二氫大馬酮對清香香韻的作用更重要。據文獻［16］報道，在研究玉溪C3F煙葉清香風格特征時發現β-大馬酮和β-二氫大馬酮在彰顯煙氣清香香韻時起主要作用。這表明兩者結果能相互印證。2種青滋香特征成分濃度均很低，但嗅覺閾值均較小，因此OAV較高。3種果香特征成分對果香香韻均有貢獻，其中己醛的貢獻最大，其次是6-甲基-2-庚酮。6種花香特征成分中，盡管苯甲醇和2-乙酰基吡咯占所有花香特征成分總量的69.20%，但其嗅覺閾值均較高，兩者OAV之和僅為0.56；苯乙醛和β-紫羅蘭酮的OAV遠大于苯乙醇和苯乙酸乙酯，在彰顯花香香韻時的作用更重要。同理，甲基環戊烯醇酮和麥芽酚（焦甜香）、愈創木酚和4-乙烯基愈創木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）在彰顯各自香韻時均起到更重要的作用。

表3 煙葉提取物中35種香韻特征成分的工作曲線與濃度分布Tab.3 Working curves and concentration distribution of 35 aroma characteristic components in tobacco leaf extracts

從各香韻特征組群的質量分數和OAV分布圖（圖1）可知，清香特征組群的質量分數和OAV分布均是最多的，其次是花香特征組群，而果香、焦甜香、辛香和豆香特征組群的質量分數盡管均遠比青滋香特征組群大，但OAV分布卻小于后者。煙葉提取物香韻特征組群的OAV分析結果顯示其香韻風格是清香為主，輔以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等香韻，整體來看香韻分析結果與文獻［2］報道的福建尤溪煙葉的香韻風格基本吻合。綜上可知，基于香氣活性值的香韻特征組群分析驗證煙葉提取物香韻風格特征是可行的。

由于煙葉提取物的致香成分數量較多，本研究中僅測得了34種香韻特征成分的OAV，且存在無標準品而無法測定OAV的情況；另外，各致香成分之間的交叉影響也未考慮。

表4 各香韻特征成分的香氣活性值Tab.4 Odor activity values of aroma characteristic components

2.5 煙葉提取物及其香韻特征成分復配物在卷煙中的應用評價

基于福建尤溪煙葉提取物香韻特征成分質量分數與OAV分析結果，將OAV＞1的成分按照定量結果進行復配，得到的煙葉提取物香韻特征成分復配物和煙葉提取物按相同條件進行卷煙加香評價，其主要香韻特征的感官評分值見圖2。

評吸結果表明：與空白卷煙相比，施加煙葉提取物的卷煙煙氣清甜香突出，蜜甜香明顯，花香微顯，香氣豐富，煙氣細膩柔和，口腔舒適度有所提升；施加煙葉提取物香韻特征成分復配物的卷煙煙氣具有類似尤溪煙葉的香韻特征，清甜香突出，蜜甜香和花香微顯，香氣質、香氣量均有所改善，無明顯口腔與鼻腔刺激，但香韻豐富程度較煙葉提取物低。基于OAV結果的煙葉提取物香韻特征成分復配物能賦予卷煙清甜香和花香香韻特征，能使香氣質提高，同時不產生明顯的刺激性，提高了卷煙抽吸品質。

圖1 各香韻特征組群的質量分數和OAV分布圖Fig.1 Contents and OAV distribution of aroma characteristic groups

圖2 煙葉提取物及其香韻特征成分復配物的主要香韻特征感官評價結果Fig.2 Results of sensory evaluation of main aroma characteristics of tobacco leaf extracts and combination of their aroma characteristics components

3 結論

（1）福建尤溪煙葉中，10種清香、2種青滋香、3種果香、6種花香、5種焦甜香、4種辛香和4種豆香特征成分的總量分別為 56.71、0.88、3.83、23.85、17.84、10.76和 14.48 μg/mL，其中香葉基丙酮、二氫獼猴桃內酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮（清香），己醛（果香），苯甲醇和2-乙酰基吡咯（花香），2（5H）-呋喃酮和糠醛（焦甜香），4-乙烯基愈創木酚（辛香），γ-丁內酯和4-甲基苯乙酮（豆香）在各自香韻中的質量分數較高。

（2）在煙葉中彰顯各自香韻特征中起重要作用的成分有β-大馬酮和β-二氫大馬酮（清香）、順-3-己烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛（青滋香）、己醛（果香）、苯乙醛和β-紫羅蘭酮（花香）、甲基環戊烯醇酮和麥芽酚（焦甜香）、愈創木酚和4-乙烯基愈創木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）。福建尤溪煙葉提取物的香韻風格是清香為主，輔以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等，與文獻［2］報道的福建尤溪煙葉香韻風格基本吻合。基于OAV分析結果的煙葉提取物香韻特征成分復配物能夠賦予卷煙清甜香、蜜甜香和花香香韻特征，香氣質提高。