飼料及飼料原料中霉菌毒素快速檢測技術研究進展

孟衛芹 王金良 沈志強,* 陳金龍

1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600

霉菌毒素(mycotoxins) 是一類低分子質量化合物，是由霉菌或者絲狀真菌在適宜條件下產生的有毒次生代謝產物[1]，廣泛存在于糧食、飼料及飼料原料中，動物食用感染的飼料可引起機體多種中毒癥狀甚至死亡，并可通過食物鏈威脅人類健康。根據聯合國糧農組織（FAO）統計，全球每年約有25%的農作物受到霉菌毒素不同程度的污染，約2%的農作物因污染嚴重失去應用價值，由此造成的經濟損失可達數千億美元。我國是家畜養殖大國，畜牧業也是我國農業的重要支柱產業，而微量的霉菌毒素便可產生巨大的毒害作用，對我國畜牧業的健康可持續發展和人類食品安全構成了巨大挑戰[1-3]。因此，快速、準確檢測飼料及飼料原料中霉菌毒素含量，是保障動物和人類健康的重要手段，現對國內外霉菌毒素及其快速檢測方法進行綜述。

1 霉菌毒素的主要種類及危害

目前，可產生霉菌毒素的真菌主要來自曲霉菌屬、鐮刀菌屬、麥角菌屬、鏈格孢屬以及青霉菌屬。發現的霉菌毒素種類已超過500 種，在飼料及原料中常見、且對動物健康危害嚴重的霉菌毒素主要有6 種，即黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1、T-2 毒素，這些毒素即使在飼料及飼料原料中含量很低，也會使其營養價值和適口性下降，引起動物免疫機能下降、生長受阻、繁殖性能降低等，且毒素間的毒副作用具有協同或加和效應[4-5]。飼料中常見霉菌毒素及其危害見表1，殘留在動物組織和動物制品中的霉菌毒素導致食品安全風險進而影響人類健康。

表1 霉菌毒素及其危害

2 霉菌毒素快速檢測技術

我國已經建立一些飼料中常見霉菌毒素的檢測標準，如GB/T 17480-2008 飼料中黃曲霉毒素B1 的測定（酶聯免疫吸附法）、GB/T 28716-2012飼料中玉米赤酶烯酮的測定（免疫親和柱凈化- 高效液相色譜法）、GB/T 8381.6-2005 配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定（薄層色譜法）、NY/T 1970-2010 飼料中伏馬毒素的測定（液質法）。這些標準大多采用高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用技術(LC-MS /MS)、薄層層析法(TLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)等。TLC 操作簡便，但靈敏度差；儀器檢測靈敏度高，但樣品處理復雜，且儀器昂貴，標準品消耗大。目前霉菌毒素殘留檢測技術的發展趨勢，要求樣品提取方便、試劑耗用少、在線自動化處理、多組分高通量地快速檢測。因此，快速檢測技術必將成為霉菌毒素殘留檢測研究的重點。

2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（ELISA）是利用酶分子與抗原或抗體相結合，然后用酶標記的抗原或抗體，與固定在聚苯乙烯材料上的抗體或抗原發生特異性反應，通過洗滌使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，經底物液反應顯色，測定光學信號強度，進而確定待檢物的含量。ELISA 方法比膠體金免疫層析快速檢測技術靈敏度更高，具有低成本、快速、操作簡單、便捷等優點，廣泛應用于醫療、食品和飼料檢測領域。龔阿瓊等[4]采用ELISA 法檢測了我國飼料原料及配合飼料中AFB1、ZEN、DON的含量。李衛娟等[5]通過ELISA 法對牧草、秸稈、青貯等反芻動物飼料中 AFB1、DON、ZEN、FB1 進行定量檢測。

2.2 化學發光酶免疫分析法

化學發光酶免疫分析方法（CLEIA）是將化學發光分析和酶免疫反應相結合而建立的一種測定方法，兼具有化學發光的高靈敏性和抗原抗體反應的高度特異性，與傳統ELISA 的主要區別是顯色系統的不同，比常規酶免疫分析法的靈敏度提高了3～5個數量級。因化學發光檢測技術靈敏度高、特異性強、成本低廉、快速穩定、檢測范圍廣、操作簡便、自動化高等優點而被廣大研究技術人員認可與推廣，廣泛應用于食品安全、環境檢測、醫藥科學和臨床疾病診斷等方面，成為藥物殘留檢測發展的一種趨勢。葉云峰等[6]采用化學發光免疫分析方法實現了糧食作物中的OTA 殘留的快速檢測。

2.3 免疫層析法

免疫層析法（IC）是以免疫滲濾為基礎發展起來的一種簡便快速的檢測方法，其原理是將特異的抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當一端浸入樣品后，由于毛細管的作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，根據顏色反應從而實現樣品的特異性免疫診斷。該方法具有操作簡便、快速經濟、靈敏度高且不需要昂貴的儀器設備等優點，特別適用于大批量樣本的快速篩查和基層檢測。隨著免疫層析技術的迅猛發展，多種納米材料標記物被應用于免疫層析試紙條，常見的有膠體金、熒光微球、量子點等，呈現出高靈敏度、可定量檢測、多元檢測的發展趨勢。與ELISA 法相比，雖然膠體金免疫層析試紙條檢測限高，但大大縮短了檢測時間。為了提高靈敏度，Wang 等[7]用熒光微球標記FB1 單克隆抗體，建立了一種檢測玉米中FB1的免疫層析法，與FB2 和FB3 的交叉反應率分別為1.5%和67.3%，回收率在90%以上。肖理文等[8]通過熒光納米微球標記玉米赤霉烯酮抗體和羊抗雞抗體，研發的玉米赤霉烯酮熒光定量試紙條，在樣品中檢測添加回收率為90%以上，3 次重復的變異系數在13.11%以內，與其他真菌毒素的交叉反應率均小于5%，滿足快速、簡便、準確定量的需求。李鑫[9]研制的多元膠體金免疫層析試紙條，可同時檢測AFB1、OTA 和ZEN 等3 種組分，檢測限分別為0.25、0.5、1 ng/mL，該試紙條特異性好，3 種真菌毒素之間無交叉反應，滿足多組分同步檢測的需要，在飼料真菌毒素混合污染同步快速檢測中具有應用前景。

2.4 核酸適配體生物傳感器

核酸適配體(aptamer)是利用體外篩選技術得到的一種功能與抗體相似的寡核苷酸片段，可與多種目標物質高特異性、高選擇性地結合，如蛋白質和藥物等，被廣泛應用于生物傳感器領域?；诤怂徇m配體的生物傳感器具有易合成、易標記、易修飾、靈敏度高、特異性高、分子質量小、檢測成本低等優勢而受到廣泛的關注。桂海孌等[10]利用非標記熒光染料PicoGreen 與雙鏈核酸結合的特異性，建立了一種快速檢測伏馬毒素B1 的核酸適配體方法，該方法的最低檢測限為 0.1 μg/L，線性范圍為0.1～1 μg/L，整個檢測流程可在40 min 內完成。喬勤勤等[11]設計的一種新型光子晶體編碼懸浮陣列適配體，可同時量化和鑒定谷類樣品中的OTA 和FB1。這些傳感器具有操作簡單、靈敏度高、親和力高等優點，并且同時檢測2 種霉菌毒素的適配體傳感器對之后同時檢測多種霉菌毒素的傳感器的發展提供了新的研究方向。

3 總結與討論

霉菌毒素快速檢測方法是在免疫學的基礎上結合膠體金、酶標記、熒光免疫、核酸適配體等技術開發出的快速、高靈敏度、高特異性的檢測方法。霉菌毒素的危害性現已被人們高度重視，而霉菌毒素的快速、準確檢測方法是當今研發人員亟需解決的問題。通過廣泛查閱文獻發現2 個問題：一是飼料中多種霉菌毒素共存的現象非常普遍，而多數檢測方法只針對一種霉菌毒素，應該建立混合污染免疫檢測技術，如研究一種便攜、親和力強、成本效益高的核酸適配體通過多種修飾，同時檢測多種霉菌毒素的快速檢測技術；二是隱蔽型霉菌毒素的檢測問題，隱蔽型霉菌毒素是指霉菌毒素通常以與糖和氨基酸等極性物質共軛的方式同時存在，難以通過常規分析方法檢測出，對動物和人類健康存在潛在風險。對于隱蔽型真菌毒素的測定思路，目前國外主要采用色譜法，學者提出理論上免疫組化法是可以替代色譜法的快速且經濟的方法，但仍處于起步階段，密切關注學習國外新技術、新方法，研發出新型霉菌毒素快速檢測技術，對加強動物飼料安全監控，保證人們食品安全與身體健康，促進社會經濟穩定發展具有重大意義。