“青蛙骨髓細胞染色體標本的制備”實驗的改進*

韓 偉 鄒佩貞 石海英 田志環(huán)

（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院 廣東韶關(guān) 512005）

根據(jù)實驗教學(xué)經(jīng)驗，對科學(xué)出版社《細胞生物學(xué)實驗教程（第2 版）》教材中的“青蛙骨髓細胞染色體標本的制備”［1］實驗提出幾點改進。

1 實驗材料的選擇

選擇飼養(yǎng)的青蛙做實驗材料。飼養(yǎng)的青蛙一年四季都可購置。青蛙雖然攜帶的寄生蟲比較多，但是相對安全，一般不攜帶人畜生共患病的病原菌，且實驗前不需要提前很長時間購買，現(xiàn)做現(xiàn)買，實驗材料準備容易方便。為了實驗?zāi)苁占礁嗟墓撬杓毎ㄗh購買較大的青蛙，一般體重在150～350 g 左右，足夠的體重，才能獲得足夠的細胞［2］。每2 名學(xué)生用一只青蛙，每名學(xué)生取青蛙的1 條后腿收集骨髓細胞。

2 秋水仙素的處理

2.1 處理時間 教材上表述實驗前3～4 h 向動物的腹腔注射秋水仙素，這個處理時間不是絕對的。筆者發(fā)現(xiàn)冬天溫度較低時（例如約10℃時），提前3～4 h，用秋水仙素處理青蛙，若時間較短，實驗結(jié)果觀察到大部分骨髓細胞分裂處于前期階段，中期分裂相較少（圖1A）。考慮青蛙冬季冬眠的原因，活動量少，應(yīng)提前較多時間用秋水仙素處理，通過實驗發(fā)現(xiàn)在室溫較低時（低于10℃），可提前10 h 用秋水仙素注射處理，特別是冬季早上做實驗時，更應(yīng)該在前一天晚上向青蛙腹腔注射秋水仙素，否則準備不方便。當室溫在25℃左右時可提前3～4 h 用秋水仙素處理，但也要合理安排上實驗課的時間。

圖1 青蛙骨髓細胞染色體標本的制備圖（10×40）

2.2 用量 秋水仙素的用量，一般根據(jù)青蛙的體重確定。教材按動物每克體重2～4 μg 的劑量進行注射。實際按每克青蛙10 μg 進行注射也得到了良好的效果（圖1B 和圖1C），這與文獻［2］和教材［3］提及的秋水仙素處理的用量一致。

3 注射生理鹽水

用刀片切開股骨的兩端，用盛有生理鹽水的

注射器插入股骨的上端，沖出骨髓細胞至離心管中，直至股骨變白色為止。采用盛有0.65% NaCl的注射器插入股骨的上端沖出骨髓細胞。

4 低滲處理

教材上低滲處理：棄上清液，加入6 mL 蒸餾水，用吸管輕輕吹打成細胞懸浮液，置于37℃溫箱中低滲20 min［1］。實驗時改為棄上清液，加入6 mL 0.4% KCl，用吸管輕輕吹打成細胞懸浮液，置于37℃水浴鍋中低滲30 min。發(fā)現(xiàn)用0.4% KCl低滲對于不熟練操作的人來說比蒸餾水效果好。這與方玲等［4］和趙剛等［5］采用的低滲液一致。

5 固定液的配制

固定液現(xiàn)配現(xiàn)用，因為冰醋酸容易揮發(fā)。采用預(yù)固定和第1 次固定時配一次，第2 次固定時再配一次。這樣固定液中的冰醋酸揮發(fā)相對較少，固定效果好。

6 染色液的配制

Giemsa 染液現(xiàn)配現(xiàn)用。于染色前30 min 將Giemsa 原液用10 倍體積的1／15 mol／L 磷酸緩沖液（pH=7.4）稀釋，配制。

7 滴片

采用濕的冰凍切片，向載玻片上滴加懸浮的骨髓細胞要有一定的高度。高度太低時細胞松散不開，高度太高則細胞容易滴到載玻片外面，一般離載玻片至少40 cm 進行滴片，滴片后用嘴向一個方向吹氣，使細胞和染色體充分分散。

8 加熱干燥

滴片置酒精燈上方來回微微加熱干燥。不能在一個位置加熱干燥，不能過分干燥。

9 顯微鏡觀察

滴片在顯微鏡下觀察，采用逐行觀察、平掃的方式，這樣才容易找到分散均勻的染色體。先在低倍鏡下觀察，再換高倍鏡進行觀察。如果能結(jié)合數(shù)碼顯微鏡互動實驗室進行觀察，學(xué)生可拍攝并保存照片，與實驗教師進行互動，實驗效果會更好。拍到的照片可用來核型分析（圖1D）。參考周洲等［6］的方法，利用Photoshop 軟件對圖1D 進行染色體核型分析，得到圖2核型分析圖。

圖2 青蛙骨髓細胞染色體核型分析圖

總之，任何實驗都不能照搬實驗指導(dǎo)教材，指導(dǎo)教材上的方法只是針對大多數(shù)情況下使用的，做實驗時要根據(jù)實際條件和環(huán)境，實時調(diào)整，制定合適的實驗步驟，才能得出好的實驗結(jié)果。