三種布魯氏菌血清抗體檢測方法在臨床應用及評價

楊興坤段建華寇俊峰焦耿軍

（解放軍聯勤保障部隊第940醫院安寧醫療區1，甘肅 蘭州，730070）

（甘肅省武威市涼州區中西醫結合醫院2，甘肅 蘭州，733000）

布魯氏菌病病是一種由布魯氏菌引起的以動物和人為傳染源的細菌性傳染疾病，其主要特點是人畜共患[1].布魯氏菌不僅感染感染途徑多樣而且臨床表現復雜多變，癥狀不同，輕重各異，給臨床診斷帶來一定的難度，容易誤診。因此實驗室診斷尤為重要。為客觀評價三種布魯氏菌血清檢測方法的檢出效果，選擇本院936例血清標本和自制50人份血清盤同時使用虎紅玻片凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、人布魯氏菌抗體膠體金法（GICA）檢測，通過實驗結果分析，對比其陽性率，靈敏度，特異性，同時對檢測方法的優缺點進行分析。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2019年1-7月期間我院門診就診患者936例血清標本，同時用RBPT，SAT，GICA三種方法檢測，利用中國疾控中心布魯氏菌陰性、陽性質控血清自制50人份血清盤，分別是30人份陽性血清標本，20人份陰性血清標本標本。

1.2 器材與試劑 儀器：賽默飛-B2生物安全柜，可調式恒溫保溫箱，可調速多用振蕩器，微量移液器（量程：1-50ul，10-200uL，00-1000ul，Electron Finnpipette）計時器。耗材：一次性載玻片（2×4cm)，一次性玻璃試管（0.5×5cm)。試劑：布魯氏菌虎紅玻片凝集抗原、布魯氏菌試管凝集抗原由遼寧吉浩生物科技有限公司生產，人布魯氏菌IgG抗體檢測試劑盒（膠體金法）由中新生物科技有限公司生產，布魯氏菌陰性、陽性質控血清，500ml無菌生理鹽水。

1.3 方法 RBPT采用玻片凝集法：在室溫環境下，先取潔凈載玻片一張，然后吸取待檢標本血清30 ul，再吸取虎紅凝集抗原30 ul充分混勻后，靜置五分鐘后觀察其凝集程度，具體參照參照 WS 269—2019《布魯氏菌病診斷標準》進行檢測和結果判定[2]。SAT采用試管凝集法：在室溫條件下，每份血清用 5支試管，第1管加入2.3ml生理鹽水，第2管不加，第3、4、5管各加入0.5ml。用移液器吸取待檢血清200ul，加入第1只試管中混勻。混勻后，以吸管吸取第1管中血清加入第2和第3管各 0.5 mL，以吸管將第三管混勻，并吸 0.5 mL加入第4管，混勻。從第4管吸取 0.5 mL加入第5管，混勻。再從第5管吸取 0.5 mL棄去。如此稀釋后，從第2管到第5管血清稀釋度分別為 1：12.5、1：25、1：50 和 1：100。加入抗原。先以生理鹽水將抗原原液作適當稀釋成抗原應用液（按照說明書操作，一般作 1：10稀釋），稀釋后的抗原應用液加入各稀釋的血清管（第1管不加，作為血清對照），每管加 0.5 mL，混勻。加入抗原應用液后第作者：INSTR-ADMIN二管至第五管，每管總量 1 mL，血清稀釋度從第二管到第五管分別為 1：25、1：50、1：100和 1：200。從第一管再吸出 0.5 mL棄去，剩 1 mL，每次實驗設立陰陽性對照。陰性血清對照，血清稀釋后加抗原應用液（與待檢血清對照相似）；陽性血清對照，其血清稀釋到原有滴度再加抗原應用液；抗原對照，適當稀釋的抗原加生理鹽水0.5 ml分別加入第 2至第 6管。則第 1管為抗體是否自凝對照，第 2至第 6管抗體稀釋倍數分別是 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。在振蕩器上混勻 5 min后，37℃孵育 20 h～ 22 h，再室溫放置 1 h～ 2 h，同時按相同方法作已知布病抗體陰、陽性血清對照試驗。結果判斷 方法：將試管與預先配制的“標準比濁管”對比，目測上部液體完全透明、管底呈明顯倒傘狀沉淀為 100%凝集：++++。上部液體近于完全透明、管底呈倒傘狀沉淀為 75%凝集：+++。上部液體略微透明、管底呈較薄傘狀沉淀為 50%凝集：++。上部液體稍微透明、管底呈不很明顯傘狀沉淀為 25%凝集：+。上部液體混濁不透明、管底無傘狀沉淀，而是圓點或圓 盤狀沉淀，為不凝集：－。對“－”性結果需再孵育 24 h，按上述標準判定結果。膠體金法：實驗嚴格按試劑說明書操作。結果判定：陽性為質控線（C)和檢測線(T)同時出現兩條紅色條帶。陰性為只在質控線（C)位置出現一條紅色帶。無效為質控線（C)和檢測線(T)均未出現紅色條帶。

1.4 統計學分析 實驗數據通過SPSS16.0軟件加以處理，數據用（%）表示，行X2檢驗，若P值＜0.05則表明差異明顯，有統計學意義。

2 結果

2.1 RBPT、SAT、GICA檢測結果分析 對936人份血清標本分別用三種方法平行檢測結果詳見下表1。

表1 RBPT、SAT、GICA檢測結果分析

2.2 RBPT、SAT兩種方法價檢測結果分析 對 936人份血清分別用RBRT與SAT兩種方法價檢測結果對比見表2。

表2 RBPT、SAT兩種方法價檢測結果分析

2.3 RBRT與GICA兩種方法檢測結果分析 對 936人份血清分別用RBRT與GICA兩種方法價檢測結果對比見表3。

表3 RBRT與GICA兩種方法檢測結果分析

2.4 RBRT與GICA兩種方法檢測結果分析 對 936人份血清SAT與GICA兩種方法價檢測結果對比見表4。

表4 RBRT與GICA兩種方法檢測結果分析

2.5 三種檢測試劑盒的性能結果 三種布魯氏菌抗體檢測試劑盒的性能見表5。

表5 三種檢測試劑盒的性能結果

3 討論

布魯氏菌病的實驗室診斷方法有：細菌分離培養、虎紅玻片凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT)、補體結合試驗（CFT)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金標試驗（GICA），抗人免疫球蛋白試驗（Coomb`s）、聚合酶鏈式反應（PCR）等，細菌分離培養技術是最傳統的布魯氏菌病細菌學診斷方法，也是診斷布魯氏菌病的“金標準”[3]，但是臨床上細菌培養的陽性率不高，因此臨床上診斷布魯氏菌病常用的方法主要有PBRT、SAT、CFT、ELSIA、GICA.RBPT是臨床初步篩查布病的常用檢測方法之一，因其在臨床檢驗中檢測成本低，敏感性強，操作簡單[4]，反應快，耗時短，適合應用于布魯氏菌病的大規模初篩檢驗，但缺點是PBRT以布氏桿菌細胞壁的脂多糖上的O-鏈抗原作為診斷靶點[5]，且布氏桿菌與小腸耶爾森O9、大腸桿菌O157、沙門氏菌具有高度的類似O抗原，易出現交叉反應，導致結果出現假陽性；另一個缺點為RBPT易受到外界因素的影響（溫度、凝集時間、光線等)，或者受采血及檢測人員水平的限制造成假陰性結果[6]。SAT是屬國內法定診斷布病的確診方法，優點為特異性、準確性高于PBPT；但缺點為與PBRT、GICA相比而言操作相對復雜，耗時長，通常須在恒溫箱放置20-22小時后，置室溫1-2小時觀察結果，且由于血清中存在不完全抗體競爭抗原而造成抗原抗體比例失調而造成前帶現象[7]，造成結果假陰性。GICA采用膠體金免疫層析技術原理，在硝酸纖維素膜上的檢測線包被重組布魯氏菌抗原，在質控線包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，在金標墊上包被膠體金標記的小鼠抗人IgG多克隆抗體。當檢測陽性樣本時，陽性血清中的布魯氏菌IgG抗體可與膠體金標記的人鼠抗人IgG抗體結合，形成免疫復合物，由于層析作用復合物與樣本在硝酸纖維素膜內向前流動。當復合物經過檢測時與寶貝的重組布魯氏菌抗原結合，形成“Au-小鼠抗人IgG單克隆抗體-布魯氏菌IgG抗體-布魯氏菌抗原而凝集顯色。其優點為操作簡單，耗時少，結果易判定，且靈敏度高，缺點為特異性差，易受到血樣、溫度、濕度的影響易出現假陰性結果。

三種布魯氏菌血清抗體檢測方法檢測結果數據分析：RBPT、SAT、GICA 三種檢測方法的陽性率分別為27.62%，19.19%，28.34%，RBPT法與GICA法相比，兩種方法陽性率高，靈敏度高，適合布病初篩。RBPT法與SAT法比較（P值＜0.05），SAT法特異性高GICA法與SAT法相比較（P值＜0.05），GICA法靈敏性高。

綜上所述，RBPT、GICA適用于大樣本量的檢驗，以及布魯氏菌病的初篩，SAT適用于小樣本量的檢驗，用于布魯氏菌病的確診.三種方法各有優缺點，在臨床實驗室診斷中應該采用RBPT、SAT或GICA、SAT聯合檢測。