柴芍承氣湯對膿毒癥大鼠小腸損傷的超微結(jié)構(gòu)及NF-κB 信號通路影響的研究

吳深寶 金忠海 宋俊英 徐小宏

（1 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院消化科 浙江 義烏 322000）

（2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院中藥科 浙江 義烏 322000）

（3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科 浙江 杭州 310005）

膿毒癥癥是一種嚴(yán)重臨床綜合征,是炎癥反應(yīng)受損的結(jié)果，以異常的生理、生物和生化過程為特征。根據(jù)一項(xiàng)國際性數(shù)據(jù)庫回顧分析，1995 年—2015 年，全球膿毒癥發(fā)生率的比率是437/100,000，每 100,000 例中有270 例發(fā)生嚴(yán)重?cái)⊙Y[1]。膿毒癥引起多器官衰竭增加病死率[2]。膿毒癥誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞功能多重紊亂，包括上皮細(xì)胞凋亡增加，屏障功能障礙和細(xì)胞因子產(chǎn)生[3]。預(yù)防膿毒癥誘導(dǎo)的小腸細(xì)胞凋亡可以提高膿毒性腹膜炎和肺炎的存活率2 到10 倍。 柴芍承氣湯（ChaiShao Chengqi Decoction，CSCD）對缺血再灌注腸損傷有一定保護(hù)作用，減少小腸細(xì)胞凋亡[4]。盲腸結(jié)扎和穿刺（CLP）是一種設(shè)計(jì)合理，易于操作和廉價(jià)的實(shí)驗(yàn)性微生物膿毒癥休克模型，也符合人類敗血癥的動物模型[5-7]。CSCD 對CLP 引起膿毒癥小腸損傷的保護(hù)作用研究極少。本研究以CLP 大鼠膿毒癥為模型載體，研究CSCD 對膿毒癥小腸損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 動物分組及膿毒癥模型的制備

30 只雄性Wistar 大鼠，體重320 ± 30g。購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為3 組：對照組（10只）、模型組（10 只）和中藥組（5ml/100g，10 只）。造模與給藥：實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水。中藥組術(shù)前1h 灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積生理鹽水。采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)制造膿毒癥大鼠動物模型[8]。造模6h 后處死大鼠。造模過程中及造模后各組大鼠均未死亡,存活率100%。

1.2 CSCD 的制作和使用方法

湯方由本院中醫(yī)科提供，中藥房熬制，湯方組成如下：柴胡10g，白芍10g，黃芩10g，枳實(shí)10g，厚樸10g，玄明粉(沖)10g，生大黃(后下)10g。前5 味中藥煮沸18min 后熄滅熱源，將生大黃加入浸泡2min，之后倒出湯液，再加入玄明粉，冷卻后即可使用。造模成功后中藥組按實(shí)驗(yàn)要求每6h 經(jīng)口灌入1 次，劑量為5ml/100g 體質(zhì)量，直至被處死為止；對照組灌入同等劑量的無菌生理鹽水。

1.3 將取好的新鮮標(biāo)本，用磷酸緩沖液清洗，2.5%戊二醛重懸，1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷：epon 樹脂=2：1 滲透過夜，包埋，超薄切片，70nm，鉛鈾染色后電鏡觀察并拍照。

1.4 準(zhǔn)確稱取小腸組織重量，按重量（g）：體積（ml）=1：9 的比例，加入9 倍體積的勻漿介質(zhì)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3500 轉(zhuǎn)/分，離心10 分鐘，取上清液檢測各組大鼠小腸組織中的髓過氧化物酶（MPO）。

1.5 Western blot 分析

將各組小腸組織按每20mg 組織加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液，提取蛋白；將各組蛋白等量上樣，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。根據(jù)說明書NF-κB 1：500 和GAPDH 1：1500 稀釋抗體，4℃孵育過夜。按照1：1000 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h。采用紫外投射凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用Quantlty one 軟件進(jìn)行灰度值分析。計(jì)算樣本目的蛋白灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，即蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大鼠小腸細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果

對照組：組織結(jié)構(gòu)較為致密，部分區(qū)域出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量較多且結(jié)構(gòu)清晰可見內(nèi)嵴；模型組：組織結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量少，崩解嚴(yán)重，形成大量空泡；中藥組：組織結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量較多，大量線粒體崩解，部分線粒體內(nèi)嵴清晰,見圖1。

圖1 各組小腸組織的透射電鏡觀察

2.2 大鼠小腸黏膜組織NF-κB 的表達(dá)

與對照組 相比，模型組NF-κB 表達(dá)水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥組與模型組相比，NF-κB 表達(dá)水顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小腸黏膜組織NF-κB 的表達(dá)

2.3 大鼠小腸組織MPO 的水平

MPO 對照組表達(dá)為1.04±0.16u/克組織濕重 ，模型組為3.46±0.21U/克組織濕重，組織濕重,2.64±0.16U/克組織濕重，兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小腸黏膜組織MPO 的表達(dá)

3.討論

C S C D 是一種傳統(tǒng)中藥方劑，據(jù)報(bào)道它具有腸道屏障保護(hù)作用。本研究檢測了CSCD 對CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小腸損傷的保護(hù)作用具體分子機(jī)制。

小腸是敗血癥中敏感的器官。本研究通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠組小腸組織組織結(jié)構(gòu)松散，自溶，線粒體崩解嚴(yán)重，形成大量空泡；中藥組小腸組織也表象結(jié)構(gòu)松散，自溶，但線粒體崩解較膿毒癥組明顯減少，部分可見內(nèi)脊。證實(shí)CSCD 對膿毒癥引起的腸損傷有部分保護(hù)作用。

M P O 是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志。中性粒細(xì)胞活化后釋放炎癥因子，引起腸組織損傷。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)腸組織中M P O 明顯增高，表明中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤增多，C S C D 可明顯降低M P O 表達(dá)水平，提示C S C D通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤，從而減輕小腸炎癥損傷。

已經(jīng)證明NF-κB 介導(dǎo)大量基因的轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物在膿毒癥病理生理學(xué)中具有重要作用[9]。 缺乏NF-κB 依賴性基因的小鼠減少膿毒性休克和膿毒癥相關(guān)病死率[10]。本研究表明，在C L P 誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠小腸組織中，N F-κ B 表達(dá)明顯升高，CSCD 抑制大鼠小腸組織中NF-κB 的表達(dá)，提示CSCD 對NF-κB 信號傳導(dǎo)途徑有抑制作用，從而減輕膿毒癥小腸損傷。

總之，本研究的結(jié)果表明，CSCD 改善膿毒癥小腸組織損傷，CSCD 的這種保護(hù)作用與其抑制中性粒細(xì)胞浸潤和NF-κB信號通路減輕炎癥反應(yīng)有一定關(guān)系。