金華地區非小細胞肺癌基因突變情況回顧性研究

王斌峰 馬擁軍 游霞 陳相劍 符芳妮 宇兆男

美國國家綜合癌癥網絡（NCCN）指南推薦的非小細胞肺癌需進行的基因檢測范圍包括EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、ERBB2、KRAS 和BRAF 八 個 基因，另外還包括PD-L1 的表達和TMB 指標。EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、ERBB2、KRAS 和BRAF的突變均有明確靶向藥物進行相應治療，PIK3CA 和NRAS 則與這些靶向藥物的耐藥相關，因此，作者將這10 個基因納入了檢測范圍。目前檢測基因突變的方法很多，包括一代sanger 測序、突變阻滯擴增PCR、FISH、高效液相色譜等。之前各國、各地區發表的很多基因突變的調查研究均是基于這些方法，但是這些技術普遍具有通量較小，無法同時進行多基因大通量檢測的弊端。隨著技術的發展，二代測序法進行肺癌的基因檢測已經被寫入了各大指南，對指導肺癌靶向用藥、研究肺癌的發生發展機制有更大的優勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取金華市中心醫院精準中心2017年1 月至2018 年1 月收治的NSCLC 患者111 例，其中男62 例，女49 例；年齡32～90 歲，平均62 歲。其中腺癌95 例，鱗癌16 例。患者均行腫瘤切除術，手術切除后癌組織經中性甲醛液固定、石蠟包埋后切片，然后經過HE 染色，選取腫瘤細胞占比＞20%的癌組織，進行基因突變檢測。

1.2 主要儀器和試劑 實驗涉及的主要儀器有NextSeq 500 測序儀（Illumina）、NanoDrop2000（Thermo）、Qubit3.0 熒光定量分析儀（Invitrogen）、4200 核酸分析系統（Agilent）、LightCycler480（Roche）等。實驗使用的試劑包括DNA 提取試劑、文庫構建試劑、測序試劑。

1.3 基因突變檢測方法 （1）DNA 提取：5～10 張FFPE 樣 本，采 用DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen）試劑盒提取基因組DNA。提取好的DNA 溶液使用nanodrop2000 進行DNA 濃度及純度檢測，濃度＞3.5ng/μl、1.8 ≤OD260/280 ≤2.1 為合格樣本。（2）文庫構建及靶向捕獲：合格的DNA 樣本經核酸打斷儀片段化，然后末端修復和加“A”尾，連接后純化并進行加index 和一輪捕獲前擴增使文庫＞45ng/μl。然后使用迪安診斷自主研發的雜交捕獲探針進行液相雜交，鏈霉親和素磁珠進行捕獲，捕獲后文庫進行二次擴增和質量控制，確保主峰大小在200～400bp，Qubit3.0 檢測文庫濃度＞1.0ng/μl。最后進行文庫定量，保證有足夠文庫用于流動槽上的簇形成后，上機測序。

2 結果

2.1 所有樣本檢出的基因突變情況 在95 例肺腺癌患者中有84 例腺癌患者（88.42%）檢出突變，在16例肺鱗癌患者中有14 例（87.5%）鱗癌患者檢出了基因突變，其中EGFR 的突變頻率最高，在67 例（60.36%）患者中檢出EGFR 突變，其中包括57 例（50%）肺腺癌患者和10 例（62.5%）肺鱗癌患者；其他基因的突變情況分別是KRAS 突變12 例（10.81%），PIK3CA 突變7 例（6.31%），ERBB2 突 變6 例（5.41%），ALK 突 變6 例（5.41%），MET 突變5 例（4.50%），RET 突變5 例（4.50%），ROS1突變3例（2.70%），BRAF突變2例（1.80%），NRAS 突變1 例（0.90%）。本研究中檢出的突變形式包括：錯義突變（37 種）、無義突變（1 種）、移碼突變（1種）、保守性同框缺失（1 種）、保守性同框插入（1 種）、非正碼缺失（1 種）、整碼插入（4 種）、整碼缺失（5 種）、整碼插入和缺失（4 種）以及融合（5 種）。

2.2 各基因具體突變形式及人群突變頻率 EGFR 的突變形式有28 種，EGFR 的突變集中在18、19、20和21 號外顯子上。共有8 例（7.21%）患者在18 號外顯子上突變，32 例（28.83%）患者在19 號外顯子上突變，在20 和21 號外顯子上突變的患者數分別是13例（11.71%）和25 例（22.52%），另外還檢測到1 例（0.9%）在4 號外顯子上移碼突變。其他基因的各種突變形式和人群突變頻率具體結果見表1。

表1 111例肺癌患者的具體突變形式統計結果

表1（續）

2.3 共突變的頻率和突變形式 在所有病例中，共有17 例患者存在共突變形式，占所有患者的15.32%，其中三突變的患者有4 例，雙突變的患者有12 例。三突變患者中，有3 例腺癌和1 例鱗癌。2 例（12.5%）腺癌患者在EGFR 上有3 個不同位點突變，1 例腺癌是EGFR 上2 個基因突變和PI3CA 突變，1 例鱗癌患者為EGFR、MET、KRAS 三個基因突變。13 例雙突變患者中，有11 例（11.58%）肺腺癌和2 例（12.5%）肺鱗癌。其中EGFR 單基因雙突位點的患者有7 例（全為腺癌），ERBB2 與KRAS 雙突的有2 例（腺癌），EGFR 與KRAS（鱗癌）、RET（鱗癌）、ROS1（腺癌）、ALK（腺癌）組合突變的各1 例。具體每位多突變患者的突變檢出情況見表2。

表2 17例患者檢出多突變情況

表2（續）

3 討論

肺癌中不同基因在不同人種中突變頻率不同。EGFR 是所有10 個基因中研究最多的。據報道，在西方人中NSCLC 患者人群中EGFR 基因的突變率低，約為10%～20%，在亞洲人群中EGFR 的突變率在50%左右［1］，在中國地區，EGFR 的突變率也有較多報道，突變頻率在40%～61%［2-3］。較多地區也發表所在地域的EGFR 的突變率，突變頻率在32%～58%［4-5］。19 號外顯子的插入缺失和20 號外顯子上的L585R 是最常見的突變形式。EGFR 上常有多突變的形式出現，雙突變出現頻率較高為0.47%～2.1%［6-7］，雙突變的患者對TKI 類藥物的響應低，其中L858R/T790M 是最常見的聯合突變。本資料中，發現金華地區的患者EGFR上不僅有8 例雙突變，突變頻率7.21%，突變頻率與以往研究相比略高，而且還發現了三突變形式。這一方面與越來越多的位點被發現相關，還與二代測序的靈敏度更高相關，許多以往在檢測下限以下的、檢測不出的位點，現在也能更準確的檢出。

關于某個特定地區內肺癌基因的突變情況，利用一代或Q-PCR 等方式已發表了很多文章來描述，多數文章的研究只關注1～3 基因，而這些基因集中在KRAS、BRAF、ALK、ROS1、MET 這幾個常見基因的組合。如江蘇地區肺癌和胃癌患者KRAS 基因突變狀態分析只關注單個基因KRAS 的突變情況，經調查發現，江蘇128 例肺癌患者中KRAS 突變頻率為6.3%［8］。杭州地區89 例肺腺癌患者EGFR、KRAS 與BRAF 基因突變狀態分析，只關注了這三個基因在杭州的突變情況調查［9］，Ⅳ期維吾爾族NSCLC 患者EML4-ALK、EGFR 基因突變狀態及生存分析，發現97 例新疆維吾爾族肺癌患者中檢出6 例（6.2%）ALK 融合［10］，在中國肺癌人群中利用二代測序的檢測方式也做了一些探索，但均未能更精細化描述至地區水平。此次研究是首次利用二代測序對金華地區的肺癌患者進行的10個肺癌驅動基因的突變情況描述。

綜上所述，利用二代測序技術觀察肺癌基因突變情況的全景，有利于短時間內發現更全面的靶藥敏感和耐藥位點，為患者提供更詳細的基因突變信息，對患者療效預測和治療方案選擇都更有意義。