miR-124通過調控PI3K/Akt信號通路對人胃癌MGC803細胞增殖與凋亡的影響

羅遠 蔣海忠

胃癌是全球高發的惡性腫瘤之一，據2015 年我國癌癥中心統計，胃癌在惡性腫瘤死亡率排名第3 位［1-2］。近年來，microRNAs（miRNAs）作為腫瘤標志物，參與胃癌的發生發展、侵襲轉移及化療抵抗，受到學術界越來越多的關注［3］。據文獻報道，miRNA 發揮癌基因和抑癌基因的功能，參與細胞增殖、凋亡和分化的調控，在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用［4-5］。其中，miR-124 在多種腫瘤中發揮抑瘤基因的功能，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌［6-9］。有學者發現，miR-124 在胃癌細胞及組織中表達下調（包括人胃癌細胞MGC803），且在胃癌的發生發展中發揮重要調控作用［5，10］。但miR-124 對胃癌細胞MGC803 的生物學功能尚未深入。因此，本研究主要探討miR-124 對人胃癌細胞MGC803 增殖、凋亡的影響，并進一步研究其調控PI3K/AKt 信號通路的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）細胞株：胃癌細胞MGC803 購自通派（上海）生物科技有限公司。（2）主要試劑：Trizol? Reagent、Lipofectamine? 2000 試 劑 均 購 自Invitrogen 公 司；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix 均 購 自TaKaRa 公 司；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TransWell小室購自上海子起生物科技有限公司；miR-124 模擬 物（miR-124 mimics）、 陰 性 對 照（mimics-NC）購自上海吉瑪公司；胎牛血清購自美國PeproTech公司；DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT 單 克 隆 抗 體、HRP 標 記 山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Abcam 公司；引物均由上海生工生物工程公司設計合成（其中miR-124 引物 序 列：Forward：5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'；Reverse ：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；U6 ：Forward：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'；Reverse：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。（3）主要儀器：1658033 小型蛋白垂直電泳轉印系統（武漢科昊佳生物科技有限公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；美國SHELLAB 2406-2 CO2培養箱（美國SHELLAB 公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶標儀（德國BMG LABTECH 公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法 （1）細胞培養：將胃癌細胞MGC803 培養在含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，用于后續的實驗。（2）細胞轉染：分別設置miR-124mimics 組與陰性對照（miR-124NC）組，待MGC803 細胞培養至對數生長期時，使用胰酶消化細胞后，洗滌2遍后應用完全培養基將細胞調至3.0×106個/ml，取200μl 細胞液接種至corning 6 孔板中培養24h。分別向三個EP 管中加入5μl LipofectamineTM2000，5μl LipofectamineTM2000+ 陰 性 質 粒miR-124 NC，5μl LipofectamineTM2000+5μl miR-124 mimics，室溫靜置5min 后混合，加入不含血清的DMEM 培養基調整終體積至2ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下培養6h后，更換完全培養基繼續培養，完成MGC803 細胞轉染，并繼續擴大培養以用于后續實驗。（3）RT-qPCR檢測轉染后細胞內miR-124 的表達：細胞轉染成功后，采用RT-qPCR 技術檢測細胞內miR-124 的表達。收集細胞后，PBS 洗滌2 遍，離心取細胞沉淀，按照Trizol? Reagent 說明書提取胃癌細胞MGC803 的總RNA，依據4×Reverse Transcription Master Mix 試劑盒說明書將組織總RNA 逆轉錄為總cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說明書操作，以cDNA 為模板，進行熒光定量PCR 反應。反應條件：94℃ 2min，94℃20s，60℃ 30s，共40 個循環。以U6 為內參，miR-124 基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。（4）CCK8 檢測細胞增殖水平：待轉染后的MGC803 細胞生長至對數期時，使用胰酶消化細胞后，洗滌2 遍后應用完全培養基將細胞調至3.0×103個/ml，每孔（96 孔板）接種100μl 細胞液。分別培養24h、48h、72h，加入配置好的CCK8 試劑（10μl CCK8 試劑+90μl 完全培養基）孵育2h，采用酶標儀檢測OD450 值。（5）細胞克隆實驗：兩組細胞以200 個/皿接種于60mm 的細胞培養皿（含10ml 培養液）中，置37℃、5% CO2的培養箱中孵育，2 周后肉眼可見細胞克隆的形成。小心吸棄培養液，用PBS 洗滌2 次，將兩組細胞以4%的多聚甲醛固定15min，再用0.1%的結晶紫染色20min，用清水清洗染液并風干，于熒光顯微鏡下隨機選取5 個視野統計形成的細胞克隆數（＞50 個克隆數為有效克隆）。（6）流式細胞術檢測細胞凋亡：消化MGC803 細胞后使用含血清DMEM 培養基將細胞濃度調至3×105個/ml，收集對數生長的各組細胞，據說明書進行操作，采用Annexin V/PI 凋亡試劑盒檢測不同時間點各組細胞的凋亡率。其中，各組樣品分別加入500μl Binding Buffer，5μl Annexin V，5μl PI，混勻，室溫避光反應5～15min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。（7）miR-124 對MGC803 細胞PI3K/Akt 信號通路的調控作用：按照1 ∶10（g/ml）的比例加入RIPA裂解液，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書方法測定所提取的各組細胞的總蛋白含量，以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組蛋白后，經SDS-PAGE電泳分離，轉至硝酸纖維素（PVDF）膜，將轉好的PVDF 膜于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2h，TBST 洗滌液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育過夜。再漂洗3～4 次，加入HRP 標記的二抗體，室溫孵育2h，漂洗3～4 次?；瘜W發光檢測底物ECL 工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統對蛋白顯影圖進行灰度分析，以β-actin 為內參，分析PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相對表達水平。再次收集MGC803 細胞后，PBS洗滌2 次，離心取細胞沉淀，按照Trizol? Reagent 說明書提取miR-124mimics 組與miR-124 NC 組胃癌細胞MGC803 的總RNA，按細胞培養方法進行PCR 擴增，均以β-actin 為內參，分別檢測PI3K、Akt 的mRNA水平。引物由上海生工生物工程公司設計提供，引物序列見表1。

表1 PI3K/Akt信號通路關鍵基因引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，應用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較兩組間各指標水平差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后MGC803 細胞miR-124 的表達及其對細胞增殖的影響 MGC803 細胞轉染miR-124 模擬物后，miR-124 的表達量為（4.15±0.18），顯著高于miR-124NC 組（2.01±0.14）（t=17.984，P=0.006）。 轉 染24h、4h 和72h 后，miR-124mimics 組 細 胞的OD450值分別為（0.46±0.09）、（0.86±0.08）和（1.08±0.13）；其中，轉染48h 和72h 后，miR-124mimics 組顯著低于miR-124 NC 組 的（1.25±0.14） 和（1.72±0.17）（t=8.245，14.257，P=0.027、0.008），結果見圖1。說明轉染miR-124 后，人胃癌細胞MGC803 的增殖能力降低。

圖1 miR-124對MGC803細胞增殖的影響

2.2 miR-124 對MGC803 細 胞 克 隆 實 驗 miR-124 mimics 組細胞克隆形成數為（71.3±4.5），顯著低于miR-124 NC 組（103.8±10.1），差異有統計學意義（t=9.450，P＜0.001）。說 明 轉 染miR-124 后MGC803細胞的克隆能力降低，進一步反映miR-124 可抑制人胃癌MGC803 細胞增殖。結果見圖2。

圖2 miR-124對胃癌MGC803細胞克隆的影響

2.3 miR-124 對MGC803 細胞凋亡的影響 細胞轉 染24h、48h 和72h 后，miR-124mimics 組 細 胞凋 亡 率 分 別 為（12.70±5.14）、（51.80±8.14）% 及（70.40±7.14）%。其中細胞轉染后48h 和72h 的細胞凋亡率顯著高于miR-124 NC 組的（24.81±7.41）%和（33.21±8.29）%，差異具有統計學意義（t=17.565、18.147，P=0.007、0.005），結 果 見 圖3。提 示 轉 染miR-124 后MGC803 細胞凋亡率提高，且凋亡率隨時間而不斷增高。

2.4 miR-124 對MGC803 細胞PI3K/Akt 信號通路的影響 細胞轉染后，miR-124 mimics 組PI3K/Akt 信號 通 路 中 關 鍵 靶 點PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相對表達分別為（0.87±0.05）、（0.95±0.11）、（0.89±0.09） 和（0.91±0.10）， 均 顯 著 低 于miR-124 NC 組（1.25±0.13）、（1.34±0.08）、（0.95±0.12）和（1.12±0.09）（t=13.542、15.224、4.159、12.357，P=0.007、0.008、0.035、0.006）。 同 時，miR-124 mimics 組PI3K/Akt 信號通路中PI3K 及Akt 基因相對表達分別為（0.73±0.08）和（0.64±0.11），均顯著低于miR-124 NC 組（0.87±0.15）和（0.94±0.10）（t=8.365、10.324，P=0.007、0.009）。提示miR-124 可抑制胃癌細胞MGC803 的PI3K/Akt 信號通路。結果見圖4。

圖3 miR-124對MGC803細胞凋亡的影響

圖4 miR-124對MGC803細胞PI3K/Akt信號通路的影響

3 討論

目前，胃癌已成為我國發病率和病死率最高的常見惡性腫瘤之一［11］，據統計我國每年胃癌新發患者達70 萬人［12］。由于胃癌的發病隱匿及診斷水平限制，多數胃癌患者在確診時已經發展為中晚期，失去了手術機會，即使早期胃癌患者在接受手術治療后仍有可能發生局部 復發或遠處轉移，導致治療失敗。故尋找新的藥物靶點已成為近年來的研究熱點，為胃癌的治療尋找新的突破。近年研究表明miRNA 可通過調控細胞增殖、凋亡和分化，促進或抑制腫瘤的惡性表型，相比正常細胞，腫瘤組織中miRNA 存在異常表達，這些異常表達的miRNA 在腫瘤形成中可能扮演重要角色，可作為生物學特性、腫瘤病因學、組織分型和臨床分級分期的分子標志物［13］。

miRNA 是一類微小非編碼RNA，其長約20～22個核苷酸［11］。在眾多miRNAs 中，miR-124 是一種新發現與胃癌有關的miRNA，與胃癌發生發展有密切關系［5，10］。據文獻報道，miR-124 在多種腫瘤包括消化系統腫瘤的細胞或組織中均表達下調。Xie 等［14］研究發現，通過上調miR-124 表達水平，高濃度的miR-124 不僅可抑制胃癌細胞增殖，還可促進胃癌細胞凋亡的作用；同時發現，與5-氟尿嘧啶聯合使用后，miR-124 對胃癌細胞的抑制作用更加明顯，這為miR-124 作為胃癌治療的潛在藥物靶點提供了有力的證據。但目前國內關于miR-124 與胃癌發生發展及相關機制的研究報道較少?；诖?，本研究成功將miR-124 轉染至人胃癌MGC803 細胞中，并進一步考察miR-124 對胃癌細胞MGC803 增殖及凋亡的影響，結果顯示miR-124mimics 組中細胞的miR-124 高表達；轉染48h 后miR-124mimics 組MGC803 細胞的增殖較miR-124 NC 組顯著降低；同時流式細胞術結果顯示，miR-124 mimics 組MGC803 細胞凋亡率較miR-124 NC 組顯著提高。由此可見，miR-124 可抑制胃癌細胞MGC803 增殖并促進MGC803 細胞凋亡。

為了進一步探討miR-124 對人胃癌細胞MGC803增殖及凋亡的作用機制，本研究采用Western blotting法和RT-qPCR 法測定PI3K/Akt 信號通路關鍵靶點蛋白和mRNA 水平。研究證實，PI3K/Akt 信號通路參與調節細胞的增殖、凋亡等重要活動，其調控的失衡與多種腫瘤的發生、發展及耐藥密切相關，已成為值得深入研究的治療靶點［15］。Akt 蛋白處于PI3K/AKt 信號通路的中心位置，經磷酸化后被激活形成p-AkT，后者進一步使多個Akt 下游蛋白發生磷酸化（包括PI3K 等），從而調控腫瘤細胞的增殖與凋亡等［16］。有學者分別檢測胃癌干細胞和胃癌細胞中PI3K、Akt 的表達，發現胃癌干細胞中PI3K、Akt 蛋白與mRNA 的表達明顯高于胃癌細胞，推測PI3K/Akt 信號通路與胃癌進展密切相關［17］。本研究考察了miR-124 對人胃癌MGC803 細胞PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達及PI3K、Akt 基因水平，發現miR-124mimics 組上述蛋白及基因表達均較miR-124NC 組顯著降低。提示miR-124 可抑制PI3K/Akt 信號通路，從而促進人胃癌MGC803 細胞凋亡，并抑制細胞增殖，與文獻報道一致［16，18］。

綜上所述，miR-124 可抑制人胃癌細胞MGC803的增殖，提高其細胞凋亡，其可能機制與抑制PI3K/Akt 信號通路表達有關。本研究可為胃癌的診斷與基因治療提供參考。