IL-1通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控椎間盤退變研究

毛強 何幫劍 張圣揚 王萍兒 徐濤濤 華江

腰痛是臨床常見的脊柱病癥［1］。引起腰痛的原因很多，其中椎間盤退變（Intervertebral disk degeneration，IDD）被認為是腰痛的最主要原因［2］。目前雖然對IDD的病理進程認識比較清楚，但其潛在的細胞和分子機制仍未完全闡明［3］。目前臨床上針對腰痛的治療方法較多，但這些手段均以緩解疼痛為目的，未對引起腰痛的根本原因椎間盤退變起干預作用。椎間盤內(nèi)炎性因子水平的上升是椎間盤退變的主要起始事件，其中IL-1 扮演了最重要的角色［4-5］，其在退變椎間盤中的活性呈顯著升高狀態(tài)。此外，有研究證實Wnt/β-catenin信號通路在椎間盤退變病理進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而IL-1 可通過激活結(jié)腸癌細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路促進腫瘤的生長，表明IL-1 與Wnt/β-catenin 信號通路間存在密切聯(lián)系。本資料通過IL-1 干預以及構(gòu)建椎間盤退變模型，探究IL-1 對椎間盤退變影響及其與Wnt/β-catenin 信號通路的關(guān)系。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性C57bl/6 小鼠，體質(zhì)量20～30g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照每12h 明暗交替，換風次數(shù)15～20 次/h。由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心飼養(yǎng)。實驗飼養(yǎng)室許可證號SYXK（浙）2018-0012。

1.2 試劑 戊巴比妥鈉（上海源葉生物科技有限公司）；二甲苯、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；蘇木素染液、組化試劑盒、DAB kit、中性樹膠（北京百奧思科生物醫(yī)學技術(shù)有限公司）；抗體β-catenin、IL-1、Collagen Ⅱ、Versican（ 美 國Abcam 公 司）；GAPDH 抗體（杭州華安生物有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光檢測試劑、預染蛋白marker（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol（生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green qPCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）。

1.3 儀器 J3353 型X 光機（南京普愛醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；μCT-100 型Micro-CT（瑞士SCANCO Medical AG 公司）；ASP200S 全自動脫水機、RM2235石蠟切片機、HI1220 烤片臺、G1150 H 加熱石蠟包埋系統(tǒng)、DM3000 正置熒光顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）；EPS300 電泳儀、VE 180C 電泳槽、VE186 轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）；LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）。

1.4 方法 （1）動物分組及給藥：小鼠隨機分為5組，分別為正常組、IL-1 低劑量組、IL-1 中劑量組、IL-1 高劑量組、椎間盤退變模型組，每組各6 只。除椎間盤退變模型組外其余小鼠不做造模處理。其中IL-1 干預組小鼠經(jīng)腹腔注射IL-1，1 次/d，低劑量組為0.04μg/10g，中劑量組為0.2μg/10g，高劑量組為1μg/10g。（2）椎間盤退變小鼠模型的制備：利用了小鼠水逃逸習慣的優(yōu)勢，將其放置于有限的含水空間中以誘導長時間雙足姿勢，增加機械壓在小鼠的脊椎上。實驗采用2L 塑料燒杯，讓老鼠在燒杯中可以活動，自行保持雙足站立動作。將模型組小鼠置于燒杯中，裝有室溫（24℃）水，水位設(shè)定為5mm，通過覆蓋小鼠腳踝，以確保其保持雙足姿勢，共6h/d，自由活動、食物和水攝入2h/次，維持6 周。（3）影像學（X 線和Micro-CT）分析：各組小鼠整個腰椎節(jié)段拍攝X線片。觀察腰椎結(jié)構(gòu)變化：關(guān)節(jié)間隙、骨贅、骨密度等情況。用Micro-CT 分析各組小鼠腰椎顯微結(jié)構(gòu)的改變，3D形態(tài)計量參數(shù)包括：骨小梁相對體積（BV/TV）、骨密度（BMC/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb. N、骨小梁密度（Tb.Th）。（4）HE 染色觀察小鼠椎間盤病理學改變：小鼠腰椎組織樣本置入4%多聚甲醛溶液中，24h 后鋸取0.5cm 骨片，隨后進行脫鈣處理。將脫鈣后的小鼠腰椎組織和對應標簽放于脫水盒內(nèi)，再將脫水盒放入吊籃置于脫水機內(nèi)依次梯度脫水。脫水后將樣本置入包埋機，先往包埋框倒入融化的蠟，再往上加浸好蠟的樣本，放入凍臺冷卻，蠟凝固后取出。切片機上切片，厚4μm 后進行常規(guī)HE 染色，中性樹膠封固后，通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。（5）免疫組化檢測相關(guān)蛋白表達：切片置于枸櫞酸液修復液中，用微波爐100 火力30min 至微微沸騰，再用50 火力維持7min，停止加熱后自然冷卻20～30min，PBS 漂洗3次。3% H2O2孵育10min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 洗3 次，滴加封閉液（5%BSA），濕盒中室溫30min，擦去封閉液后滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜，PBS 洗去一抗。滴加生物素化二抗工作液，孵育20min，PBS 洗去二抗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，孵育20min。DAB 顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。（6）Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達：取100mg 椎間盤組織樣品置于培養(yǎng)皿中，加入適量液氮，用研缽充分研磨，加入Lysis Buffer，組織勻漿機中進行勻漿（3×20s），使組織盡量碾碎，冰上靜置裂解15～30min。將勻漿液放入離心管中，12000g，4℃離心5min，取上清轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中，用BCA 試劑盒測濃度，處理蛋白隨后上樣。用SDS-PAGE 分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育2h 后顯影。（7）qRT-PCR 檢測相關(guān)基因表達：將100mg 組織加入1ml 的Trizol 至勻漿管中，將裂解后樣品室溫放置5min，使得核mRNA與核酸完全分離。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求逆轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA 作為模板，通過SYBR Green qPCR試劑盒要求進行qRT-PCR 反應，引物信息如表1 所示。PCR 反應條件為：95℃變性10min；95℃變性15s，60℃退火延伸60s，40 次循環(huán)。

表1 引物序列信息

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 X 線觀察各組小鼠腰椎結(jié)構(gòu)變化 正常組小鼠脊柱呈正常生理彎曲，椎間隙未見明顯變窄，椎體排練整齊。模型組、IL-1 干預組相較于正常組，側(cè)位X 光可見，模型組小鼠脊柱彎曲明顯，正位X 光也可見小鼠脊柱由側(cè)圖表現(xiàn)，椎間隙相較于正常組變窄。椎間盤退變嚴重程度從高到低依次為IL-1 高劑量組、椎間盤退變模型組、IL-1 中劑量組、IL-1 低劑量組、正常組。見圖1。

圖1 X線觀察各組小鼠腰椎結(jié)構(gòu)變化

2.2 Micro-CT 分析各組小鼠腰椎顯微結(jié)構(gòu)改變 圖2為Micro-CT 拍攝結(jié)果圖，由表2 分析可知，BMC/TV及Tb.N 兩個數(shù)據(jù)，模型組較正常組明顯降低，且有顯著性差異（P＜0.01）；IL-1 干預組BMC/TV 和Tb.N 兩個指標較正常組數(shù)值明顯降低，其中IL-1 中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或0.01）。而各組的BV/TV 和Tb.Th 兩個數(shù)值無明顯差異。

圖2 Micro-CT觀察各組小鼠腰椎顯微結(jié)構(gòu)改變

表2 各組小鼠腰5錐體Micro-CT檢測結(jié)果［n=6，（±s）］

表2 各組小鼠腰5錐體Micro-CT檢測結(jié)果［n=6，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05，# P＜0.01

組別 BMC/TV（mg HA/ccm） BV/TV Tb.N（1/mm） Tb.Th（mm）正常組 227.56±18.83 0.29±0.04 4.36±0.18 0.06±0.01 IL-1 低劑量組 200.74±13.90 0.30±0.03 3.70±0.21 0.06±0.01 IL-1 中劑量組 161.35±12.53* 0.26±0.07 3.39±0.08** 0.06±0.01 IL-1 高劑量組 135.72±16.01** 0.23±0.06 3.17±0.79** 0.05±0.01椎間盤蛻變模型組 156.34±9.60** 0.27±0.09 3.47±0.06** 0.05±0.02

2.3 各組小鼠椎間盤病理學改變 HE 染色結(jié)果如圖3 所示，正常組小鼠椎間盤纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，終板軟骨正常，排列緊密。IL-1 干預組及椎間盤退變模型組小鼠，可見纖維環(huán)厚度明顯變薄，說明椎間隙較正常組變窄，終板軟骨厚度較正常組變薄，且出現(xiàn)異常形態(tài)細胞。病理改變程度從高到低依次為IL-1 高劑量組、椎間盤退變模型組、IL-1 中劑量組、IL-1 低劑量組、正常組。

2.4 免疫組化檢測各組小鼠相關(guān)蛋白表達 如圖4 和表3 所示，各組小鼠椎間盤中均有IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ及Versican 陽性表達。IL-1、β-catenin 指標，椎間盤退變模型組及IL-1 干預組相較于正常組陽性表達明顯升高（P＜0.05 或0.01），陽性表達從高到低依次為IL-1 高劑量組、椎間盤退變模型組、IL-1 中劑量組、IL-1 低劑量組、正常組。Collagen Ⅱ、Versican 指標，椎間盤退變模型組及IL-1 干預組相較于正常組陽性表達明顯降低（P＜0.05 或0.01），陽性表達從高到低依次為正常組、IL-1 低劑量組、IL-1 中劑量組、椎間盤退變模型組、IL-1 高劑量組。

圖3 各組小鼠椎間盤病理改變情況

圖4 各組小鼠椎間盤內(nèi)IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican的表達情況

表3 各組小鼠椎間盤內(nèi)相關(guān)蛋白的表達情況［n=6，IOD，（±s）］

表3 各組小鼠椎間盤內(nèi)相關(guān)蛋白的表達情況［n=6，IOD，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別 IL-1 β-catenin Collagen Ⅱ Versican正常組 1587.4±416.6 2148.7±401.7 6006.0±1618.7 2479.8±561.2 IL-1 低劑量組 1665.1±217.4 2696.1±394.4* 4951.1±957.5 2240.6±351.4 IL-1 中劑量組 1771.1±418.4 3046.8±747.9* 3119.1±909.2# 2164.3±231.6 IL-1 高劑量組 2901.4±1325.8* 7362.4±1392.0# 2763.8±330.4# 1714.2±371.5*椎間盤退變模型組 2203.4±123.1* 5091.6±1018.9# 2764.0±603.0# 1734.7±137.3*

2.5 Western blot 檢測各組小鼠相關(guān)蛋白表達 如圖5所示，與空白對照組比較，IL-1 低、中、高劑量干預組和椎間盤退變模型組小鼠椎間盤組織中β-catenin及IL-1 蛋白 表 達 水平顯 著 上升（P＜0.05 或0.01），IL-1 中、高劑量干預組和椎間盤蛻變模型組小鼠椎間盤組織中Collagen Ⅱ及Versican 水平顯著下降（P＜0.05或0.01）。

圖5 各組小鼠椎間盤內(nèi)IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican蛋白的表達情況與正常組比較，?P＜0.05，?? P＜0.01

2.6 qRT-PCR 檢測各組小鼠相關(guān)基因表達 根據(jù)圖6 可得，與空白對照組比較，IL-1 中、高劑量干預組和椎間盤退變模型組小鼠椎間盤組織中β-catenin 及IL-1mRNA 表達水平顯著上升（P＜0.05 或0.01），IL-1中、高劑量干預組和椎間盤退變模型組小鼠椎間盤組織Collagen Ⅱ及Versican mRNA 水平顯著下降（P＜0.05或0.01）。

圖6 各組小鼠椎間盤IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican基因的表達情況與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3 討論

本研究通過構(gòu)建椎間盤退變小鼠模型以及IL-1 干預的方法，研究激活I(lǐng)L-1 的表達對小鼠椎間盤退變的影響，首先采用影像學（X 線和Micro-CT）方法觀察IL-1 對小鼠椎間盤結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示IL-1 干預組小鼠與椎間盤退變模型組小鼠具有相似的結(jié)構(gòu)改變，證明IL-1 干預能夠明顯誘導小鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性改變。進一步通過HE 染色檢測IL-1 對小鼠椎間盤病理學改變的影響，結(jié)果表明，相較于正常組小鼠，IL-1 干預組和椎間盤退變模型組小鼠的椎間盤均發(fā)生明顯的病理改變，且病理改變程度隨IL-1 劑量的增加而增大。

Wnt/β-catenin 信號通路可調(diào)節(jié)多種細胞的增殖和分化，從而參與組織的退變和再生。Wnt/β-catenin信號通路對維持椎間盤的生長發(fā)育及功能亦有重要作用，多個研究均揭示了Wnt/β-catenin 信號通路在椎間盤退變病理進程中的關(guān)鍵作用［6］。β-catenin 陽性細胞伴隨著椎間盤退變的進展而增加，β-catenin 蛋白的表達水平在人退變椎間盤中顯著上調(diào)［7］。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)活化小鼠椎間盤中的Wnt/β-catenin 信號通路，會誘導其椎間盤出現(xiàn)與人椎間盤退變類似的組織病理學表現(xiàn)和分子學特征［8］。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路在椎間盤退變時被激活，并推動整個病理進程的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過免疫組化、Western blot 以及qRT-PCR 的方法，檢測IL-1 干預后小鼠中β-catenin蛋白以及mRNA水平的表達情況。結(jié)果顯示，相較于正常組，IL-1 干預組和椎間盤退變模型組小鼠中IL-1 和β-catenin 的蛋白和mRNA 水平均顯著增高，充分證明IL-1 能夠上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路的活性，進而調(diào)控椎間盤病變。

椎間盤的主要成分是水、膠原和蛋白多糖，正常情況下纖維環(huán)中含有60% Ⅱ型膠原和40% Ⅰ型膠原，因此膠原的退化和減少也是椎間盤退變的主要組成部分［9］。當發(fā)生椎間盤退變時，Ⅱ型膠原（Collagen Ⅱ）蛋白的表達顯著降低，因此，能夠根據(jù)Collagen Ⅱ在椎間盤中的表達量來判定椎間盤的退變程度。細胞外基質(zhì)蛋白Versican 是一種分子量較大的硫酸軟骨素蛋白聚糖，隸屬于外源凝集素家族。研究表明Versican與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系［10］。本研究通過免疫組化、Western blot 以及qRT-PCR 實驗，檢測各組小鼠椎間盤組織中Collagen Ⅱ和Versican 蛋白及mRNA 的表達量，結(jié)果表明，IL-1 干預組和椎間盤退變模型組中Collagen Ⅱ和Versican 的表達量顯著降低，進一步從蛋白和分子角度證明了IL-1 能夠通過Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控椎間盤退變。

綜上所述，本研究通過IL-1 干預和構(gòu)建椎間盤退變小鼠模型，采用影像學分析、檢測相關(guān)蛋白和基因的表達變化等手段，證明IL-1 能夠通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控椎間盤退變。