食管鱗癌中BMP10 的表達及其與上皮間質轉化的相關性研究

雷海鳴 李劍 王山

（1 江蘇醫藥職業學院臨床醫學院 江蘇 鹽城 224005）

（2 江蘇省鹽城市第二人民醫院胸外科 江蘇 鹽城 224003）

食管癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，我國是食管癌高發區，國內惡性腫瘤中其發病率排第四位，我國男性常見癌癥中，食管癌占第3位，女性中位于第5位[1]，全球約60% 的食管癌發生在我國。食管癌的主要類型為鱗癌，其早期診斷比較困難，雖然外科手術和放化療等治療手段在不斷發展，但預后仍然較差，五年生存率低，其主要原因與腫瘤的浸潤、轉移和復發等因素有關。

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）是一種小分子量的分泌性多功能糖蛋白，是轉化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族成員之一，最初是因其能誘導、促進骨骼的形成而得名[2,3]，現已發現的BMP 有20 多種。BMPs 具有調節組織細胞的增殖、分化和凋亡的功能，與胚胎的生長發育、腫瘤侵襲轉移等有密切關系[4,5]。BMP10 在人體中廣泛分布，其在血管生成中具有重要作用[6]。有研究發現缺乏BMP10 的小鼠死于心臟缺陷，提示BMP10 在心臟發育中起關鍵作用[7]。BMP10 可以通過Smad 依賴性途徑抑制前列腺癌細胞的生長，侵襲和遷移[8]。BMP10 降低與乳腺癌的疾病進展、骨轉移和不良預后相關[9]。但BMP10 在食管鱗癌方面發揮的作用在國內外尚無明確的報道。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞在生理或病理情況下向間質細胞的轉變，大量研究發現,EMT 不僅在胚胎發育過程中起作用,也是導致腫瘤侵襲、轉移的一個重要機制[10]。

本研究通過檢測食管鱗癌組織、癌旁正常組織BMP10 和癌組織EMT 標記物的表達，進行相關性分析，以探討BMP10 與食管鱗癌侵襲、轉移的關系。

1.資料與方法

1.1 標本

收集江蘇省鹽城市第二人民醫院2018 年1 月—2019 年10月行手術治療的50 例食管癌患者的癌組織、癌旁正常組織(距離癌灶邊緣＞5cm，病理證實未發現腫瘤細胞)。所有患者術前未發現明顯手術禁忌證、均未進行放化療，術后病理檢查均確診為鱗狀細胞癌。50 例食管癌患者中，男性39 例，女性11例，年齡42 ～75 歲，＞60 歲31 例，其余≤60 歲。根據第8版AJCC食管癌TNM分期，Ⅱ期32 例，Ⅲ-Ⅳ期18 例。浸潤深度：T1-T2 40 例，T3-T4 10 例。組織分化程度：高分化3 例，中分化35 例，低分化11 例，未分化1 例。淋巴結轉移：發現淋巴結轉移13 例，未發現淋巴結轉移者37 例。

1.2 主要試劑

兔抗人BMP10、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 抗體；山羊抗兔二抗；免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒等。

1.3 免疫組化檢測BMP10、EMT 相關標記物的表達

所有標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，行連續切片，每張厚度4μm，用二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，內源性過氧化物酶在37℃下封閉20min；加一抗(稀釋比例BMP10 為1：100，E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 為1：200)，4℃孵育過夜；二抗在37℃下孵育30min；DAB 中顯色，在顯微鏡下觀測并拍照。鏡下選取5個視野觀察，根據陽性細胞所占的比例進行評分，＜20%為陰性,≥20%為陽性。BMP10、E-cadherin和N-cadherin 的陽性著色位于細胞膜和細胞質，Vimentin 陽性著色主要位于細胞質(見圖1)。

1.4 統計學分析

采用SPSS20.0 軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

圖1 食管鱗癌組織中BMP10、N-cadherin,vimentin 和E-cadherin 的表達(SP×400)

2.結果

2.1 BMP10 在食管鱗癌與癌旁正常組織中的表達

50 例食管鱗癌組織中BMP10 的陽性表達率為42.0%，癌旁正常組織的陽性表達率為64.0%，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 食管鱗癌中BMP10 的表達與臨床病理資料間的關系

BMP10 在不同性別、年齡、浸潤深度、組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期中的表達情況見表1。

BMP10 的表達與患者的性別（P=0.668）、年齡（P=0.563）和組織學分級（P=0.979）無關，與浸潤深度（P=0.022）、臨床分期（P=0.034）及淋巴結轉移（P=0.024）有關(表1)。

表1 BMP10 的表達與食管鱗癌患者臨床病理資料之間的關系

2.3 食管鱗癌中BMP10 的表達與EMT 相關標記物表達的相關性

BMP10、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 在食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為42%、40%、54%、56%。分析顯示，食管鱗癌組織中BMP10 的表達與E-cadherin 表達呈正相關(r=0.463，P＜0.05)，與N-cadherin 表達呈負相關(r=-0.434，P＜0.05)，與Vimentin 表達也呈負相關(r=-0.307，P＜0.05)，見表2。

表2 BMP10 與N-cadherin、E-cadherin、vimentin 表達的相關性

3.討論

B M P s 家族成員廣泛參與人體多種生物學過程，與細胞增殖、分化、遷移及腫瘤侵襲、轉移有關。有研究發現,BMPs家族的多個成員參與了食管鱗癌細胞的生長、侵襲和轉移過程。B M P6/7 過表達激活S M A D 1/5/8 信號通路并誘導下游基因I D1 表達，促進了癌細胞的生長、侵襲和轉移，而BMP2/4 的過表達則促進了ERK1/2，P-38 和JNK 的活化，減少了癌細胞的生長、侵襲和轉移[11]。

BMP10 為血管生成的重要調節劑，主要由心臟產生，血漿濃度0.5 ～2n g/m l,在心臟發育中發揮重要功能[12]。近年來許多研究報道BMP10 表達與多種腫瘤的發生、發展和轉移密切相關，如肝癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等[13-17]，這些研究發現BMP10 具有抑制腫瘤細胞增殖作用。我們的前期研究也發現，B M P10 在胃癌組織中的表達下調，可抑制胃癌細胞的生長、遷移和轉移[18]，但該蛋白在有關食管鱗癌方面的報道目前國內外尚未發現。

結果顯示，BMP10 在食管鱗癌組織中的表達低于癌旁正常組織(P＜0.05)，提示B M P10 可能在食管鱗癌中具有抗癌潛力。B M P10 在食管鱗癌中的表達與患者的性別、年齡和組織學分級無明顯相關性(P＞0.05)，與淋巴結轉移、浸潤深度及T N M 臨床分期有相關性(P＜0.05)，提示B M P10對食管鱗癌的侵襲、轉移可能具有抑制作用。

上皮- 間質轉化（E M T）在胚胎發育和組織修復過程中具有重要作用，也與腫瘤細胞的侵襲、轉移密切相關。E M T的主要表現是N-cadherin 的表達上調及E-cadherin 的表達下調[19]。在乳腺癌中，BMP 途徑可抑制由TGF-β 途徑介導的EMT，但在前列腺癌和肝細胞癌中，BMP 促進EMT 過程[20]。

我們對食管鱗癌組織中B M P10 與E M T 相關標記物進行相關性分析，結果顯示食管鱗癌組織中B M P10 表達與E-c a d h e r i n 表達呈正相關(r=0.463，P＜0.05)，而與N-cadherin 及Vimentin 表達呈負相關(r=-0.434，r=-0.307，P＜0.05)，提示B M P10 可能通過調控E M T 標記物的表達而抑制EMT 的發生，發揮抑制食管鱗癌侵襲和轉移的重要作用。

綜上所述，在食管鱗癌組織中B M P10 的低表達，可能對食管鱗癌的進展發揮了抑制作用。E M T 的發生受到多種細胞因子、蛋白、信號通路和微環境的調控，B M P10 可能具有抑制食管鱗癌中的EMT 過程的作用，但具體作用機制尚不清楚，是否也通過抑制由T G F-β 途徑介導的E M T，有待更深入的研究。