2-氨基咪唑衍生物的合成及其細菌生物膜抑制活性研究

楊瓊敏 程鋮 楊果 楊元勇（通訊作者）

（1 貴州醫科大學藥學院 貴州 貴陽 550025）

（2 安順市婦幼保健院 貴州 安順 561000）

細菌生物膜（Bacterial biofilms，BF）是由細菌分泌的核酸、蛋白質以及多聚糖等組成的胞外聚合物[1]。研究表明，生物膜為成熟細菌提供保護[2]，是細菌耐藥的最主要原因，由于生物膜的存在使得細菌耐藥性增加10 ～1000 倍。細菌耐藥性是目前全球面對的嚴峻問題，基于此，通過抑制細菌生物膜從而降低細菌耐藥性的產生是一種全新的抗菌策略[3]。此外，由于生物膜對游離細菌的保護作用，導致細菌感染難以治愈并且有反復感染的可能[4]。

在生物膜形成過程中，細菌群體感應（Quorum-Sensing，QS）系統起著至關重要的作用[5]。群體感應現象是細菌之間信息傳遞的一種方式，即細菌能自發產生、釋放特定的化學物質進入環境中，當濃度達到一定閾值后，即可啟動相應基因的表達對群體行為進行調控的一種現象[6]。這種化學物質被稱為細菌的自誘導物(Autoinducer，AI)。QS 不僅能夠調控生物膜的形成，而且能夠調控細菌的多種生物學功能如毒力產生、生物熒光、致病基因的表達等[7,8]。

由此可見，群體感應系統在生物膜形成中起著至關重要的作用。近期研究表明，通過外加小分子化合物或者酶以干預或猝滅信號分子，從而干擾群體感應系統可以有效降低生物膜的形成。具體方法是通過化學合成自誘導劑結構特性相類似物，這些化合物能競爭性的與自誘導劑受體蛋白相結合，從而抑制生物膜的形成[9,10]。

本文旨在合成根據革蘭氏陰性菌自誘導物結構特性從而合成出其結構類似物，用于測定對于A.bauman Ⅱ、E.coli和P.Aeruginosa 三類菌株BF 的抑制情況，為以后的抗菌藥物研究提供理論參考。

1.資料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

紫外—可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；酵母提取液（生工生物工程（上海）股份有限公司）；胰化蛋白胨（生工生物工程（上海）股份有限公司）；結晶紫（阿達瑪斯試劑有限公司）；36%乙酸溶液（天津市富宇精細化工有限公司）；95%乙醇溶液（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目標化合物的合成 在250mL 圓底燒瓶中依次加入1.08g2-氨基咪唑原料（5m mol），1.07mL 氯甲酸芐酯原料（5mmol），再加入Et3N（5mmol）作為堿，DCM5.00mL 作為溶劑，室溫反應8h，經薄層色譜法檢測（石油醚∶乙酸乙酯=1 ∶1），確認反應結束后，用乙酸乙酯萃取三次，有機相用Na2SO4 干燥，靜置，抽慮，用旋轉蒸發儀蒸干，得白色粉末，后用乙酸乙酯和水進行重結晶，過濾得純品。共計合成出9 個化合物，結構如圖1。

圖1

1.2.2 活性測試 使用96 孔聚苯乙烯板構建生物膜，測定其形成能力。在96 孔板中，每孔加入190μL 菌液和10μL 上述合成的化合物溶液，每個樣品平行測定8 孔，通過調節OD600值使菌液濃度達到106C FU/mL，并將化合物終濃度調節至100mol/L。其中鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）僅為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）缺失一段abaI 基因，因此將鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）僅僅設置為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）中的陰性對照。在37℃恒溫培養箱中靜止培養24h。

培養24h 后，將96 孔板中菌液吸出，用雙蒸水反復沖洗兩次（200μL/孔），以去除浮游菌；將雙蒸水吸出，加入95%乙醇溶液（200μL/孔），固定生物膜30min；將固定液去除，自然風干后，加入1%結晶紫染液（200μL/孔），在室溫下染色10min；丟棄染液，用流水把多余的染液沖洗干凈；并室溫涼干或在37 ℃烘箱中烘干；完全干燥后，加入36%乙酸溶液（200 μL/孔），在電熱恒溫培養箱中以37 ℃作用30 min 以溶解結晶紫；在570nm 單波長條件下，用酶標儀測定培養孔中溶液的OD 值。

2.結果

每個化合物和每種菌株均為8 個復孔，將最終讀數去掉最高值和最低值，計算平均值和標準差。以未加目標化合物，以10μ L D M S O 溶液代替的菌液作為空白對照。其中，將缺失一段abaI 基因的鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △a b a I）不加目標化合物，設置為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）中的空白對照。9 種化合物對鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）、銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）、大腸桿菌（E.coli DH5α）生物膜抑制活性測試結果見圖2-4。

圖2 鮑曼不動桿菌生物膜OD 值Fig.2 OD value of Acinetobacter baumann Ⅱ biofilm

圖3 銅綠假單胞菌生物膜OD 值Fig.3 OD value of Pseudomonas aeruginosa biofilm

圖4 大腸桿菌生物膜OD 值Fig.4 OD value of E.coli biofilm

3.討論

在鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）生物膜抑制活性測試中，這一種細菌BF 九個目標化合物均對其生物膜有抑制作用，其中化合物Ⅴ（N-（1H-咪唑-2-基）十二酰胺）具有較強抑制活性，與其他化合物相比，直連烷烴的效果較好，且12 個碳原子效果最佳。后期研究將以此作為指導進行下一步結構改造。

銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）生物膜形成能力測試中，九個目標化合物中僅有一個化合物對其生物膜有抑制作用，且活性偏低，基本可認為無抑制作用。需要合成更多具有與AHLs 相似具有親水親脂基團的化合物，進行BF 抑制活性測試。

大腸桿菌（E.coli DH5α）是生活中極為常見的細菌，在本次生物膜抑制活性測試中，九個目標化合物均對其有較好的抑制作用，且抑制程度相近，其具體應用還有待進一步的研究。

本次研究提供了數個具有活性的生物膜抑制劑，主要意義在于希望為后續的抗菌藥物研發提供理論參考，以及為新型抗菌藥物研發提供候選化合物。