黑曲霉高產β-葡萄糖苷酶菌株的誘變、篩選及發酵條件優化

孫智 郭金玲 龔大春 古永紅 文曉敏 劉君子 肖玲玲

【摘 要】文章主要是以黑曲霉TJ02為出發菌對其的孢子進行了硫酸二乙酯化學的誘變，同時對該菌株的發酵培養基進行了優化，然后以玉米芯為主要碳源，對該菌株中的β-葡萄糖苷酶的溫度以及穩定性展開了測試。

【關鍵詞】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;誘變

纖維素酶是一種多組分良好的酶系統。根據其誘導反應的程度，它具有重要的功能。內切葡聚糖酶（英文縮寫EG）、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷三種主要類型。酶（縮寫為BG）協同作用促進纖維素的降解而不產生長纖維聚糖和醛糖。這些糖最終被水解成糖。此外，β-糖苷酶將醋酸時間內迅速釋放的纖維結構半乳糖降解為肝糖原，促進其清除。抑制酶組分是水解過程的最后一步，也是受外界因素制約的最關鍵因素。纖維素酶的產生菌是木霉菌。所產酶系具有較高的斜葡萄糖寡糖和外源葡萄糖苷酶活性，但β-葡萄糖苷酶數量相對不足，生物降解效率和質量較低。米曲霉具有獨特的高β-糖苷酶活性。在酶體系中加入該酶還可以大大提高富含纖維素的核桃木復合材的速度和效率。本研究通過硫酸二乙酯的化學誘變，獲得了一株遺傳基因相對穩定的菌株。優化了黑青霉β-糖苷酶高產突變株DES-7，并對其培養的碳源和氮源進行了優化。確定了β-葡萄糖苷酶的最適pH和最適室內溫度，并測定了其pH穩定性和熱穩定性。

1測定基本情況

1.1黑曲霉致死率的測定

用氯酸鹽人工誘導tj02黑曲霉。隨著漸進突變育種時間的延長，細胞質的死亡率會增加。硫酸乙酯多倍體時間為10min時，孢子囊死亡率僅為23.2%;誘變育種時間延長至30min時，孢子囊死亡率提高到85.3%;化學誘變時間為40min時，卵死亡率為95.8%;50 min和60min時，孢子囊死亡率為95.8%，死亡率在60%以上。根據死亡率選定硫酸二乙酯，后續治療時間為30min[1]。

1.2高β-葡萄糖苷酶活菌株的誘變及篩選

用硫酸二乙酯處理的孢子囊懸浮液包被在PDA板上。隨機選擇25個突變株并將其疫苗接種在新的PDA平板設備上以進行重新分離和純化。通過刮除誘變環獲得的點突變菌株的孢子囊疫苗在次級發酵瓊脂培養基中進行二次發酵和連續培養。確定β-葡萄糖苷酶以進行初步篩選。突變體des-7和des-11的酶活性大大提高。

1.3遺傳穩定性

通過這種初步篩選獲得的突變菌株DES-7和DES-11被連續培養了8代，并確定了親本的遺傳穩定性。DES-7的β-葡萄糖苷酶活性比突變體DES-11的穩定。與原始菌株TJ02相比，β-葡萄糖苷酶活性提高了30%以上[2]。

1.4碳源對β-葡萄糖苷酶產量的影響

通過使用麩皮，芝麻桿，玉米芯（Wangetal，2011），木糖殘渣，油炸的麥稈，微晶纖維素等，將一系列最便宜易得的原料用作研究的主要原料，檢測其對β-葡萄糖苷酶對菌株的影響。當玉米芯用作碳源時，分離株發酵液中的中間蛋白和β-葡萄糖苷酶的生物活性最大，前者為0.48g/L和13.78IU/mL。緊接著進行蒸汽噴射的小麥，稻稈和麩皮，其次是玉米。核心是唯一的碳源。研究了相同高濃度對細菌產生的β-葡萄糖苷酶的影響。以玉米芯為唯一底物，其濃度比對噬菌體產生的β-葡萄糖苷酶的失活有重大影響。當玉米芯的濃度為50g/L時，β-葡萄糖苷酶活性達到39IU/ml10。902菌株的生產力將隨著玉米芯濃度比的增加而增加。這可能與絲狀真菌的高密度菌絲有關[3]。如果底物纏結的濃度太高，則二次發酵液相對較厚，這不利于分離物的產生。與小麥核心（50g/L）作為碳源相比，使用了天然的初始發酵培養基（玉米芯核心麩為發酵底物時β-葡萄糖苷酶活作為28iu/ml），腸球菌的容量規模也很差。

1.5氮源對β-葡萄糖苷酶產量的影響

在恒溫、氮氣濃度不變的前提下，以（NH4）2SO4、（NH4）2CO、NH4COOCH3、NH4Cl、NaNO3、干酵母粉、小麥充分攪拌和玉米蛋蛋白胨為兩種不同類型，8種成分成為研究芽孢桿菌對β-葡萄糖苷酶產量的影響、（NH4）2SO4和復合肥在無機物氮源中對細菌酶的產生比三種組分更為不利;考慮到市場因素，（NH4）2SO4是最有利的無機復合氮源;發酵粉是最好的無機相氮源，初始瓊脂培養基中的氮源為（NH4）2SO4與酵母粉混合，發酵的最佳效果高于多種組分，說明（初始液體培養基中的（NH4）2SO4和酵母發酵粉效果。

1.6β-葡萄糖苷酶表觀酶學性質研究

1.6.1 β-葡萄糖苷酶的最適溫度

為了更好地確定β-葡萄糖苷酶的最佳溫度，在不同攝氏度的基本條件下測量了β-葡萄糖苷酶的酶活性。當溫度降至55°C時，酶的活性可以達到最高。觀察β-葡萄糖苷酶活性的變化曲線：當總溫度低于55℃時，酶活性隨室內溫度的升高而增加;當總溫度為60℃時，酶活性降低。當攝氏溫度超過70°C時，酶活性急劇上升，降至最佳總溫度的30%。

1.6.2 β-葡萄糖苷酶的最適pH

在pH為2.0-9.0的相同緩沖空間溶液中，準確地測定了β-過氧化物酶的活性物質與pH的關系。由該菌株產生的β-葡萄糖苷的活性隨pH而顯著變化，并且其酶活性pH4.0左右是最高的，表明菌株所產的β-葡萄糖苷酶是一種弱酸性的β-葡萄糖苷酶，它的最佳pH值約為4.8。

1.6.3 β-葡萄糖苷酶的熱穩定性

測定β-葡萄糖苷酶的熱穩定性，并在37℃、50℃和65℃下測定β-葡糖苷酶的活性。β-葡萄糖苷酶的熱穩定性在37℃時最好，24hβ-葡萄糖苷酶的活性為95%。溫度到50攝氏度℃是β-葡萄糖苷酶的熱穩定性最高，且24小時內β-葡萄糖苷酶的活性為90%。溫度為65時℃β-葡糖苷酶的穩定性較差，β-葡糖苷酶的全活性在6小時內降至0。

1.6.4 β-葡萄糖苷酶的pH穩定性

在不同pH條件下于50℃保溫2h后，測定β-糖苷酶的相對酶活性。在50℃加熱2h后，β-糖苷酶在pH 4.0至6.0具有良好的穩定性，酶活性為大于85%。在pH 8.0的條件下，在50℃下保溫2小時后，酶活性僅為原始酶的50%。

2討論

β-葡萄糖苷酶也稱為葡糖苷酶水解酶，也稱為龍膽二糖酶，長纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它屬于蛋白水解酶的類別。來自相同來源的芥子油苷酶的分子量和范圍從數十kDa到數百kDa。葡糖苷酶最早是在1837年由Liebig和Wohler在苦腰果中發現的。作為纖維酶的組成部分，芥子油苷的主要基本功能是使非真實的還原性糖苷鍵與糖鏈末端復合，并根據實際情況釋放葡萄糖和配體。另外，β-葡萄糖苷酶可以弱化對硝基苯半乳糖不耐受性和脫氫肋骨內酯，這在生產實踐中起著重要作用[4]。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系統中最重要的酶。當乙酸纖維蛋白酶富含纖維素時，它的重復使用和葡萄糖苷酶的缺乏將導致大量纖維素二糖積聚。乳糖的大量積累實際上將對酶促反應形成非常強的即時反饋抑制作用。纖維素酶水解并顯著增強果膠酶。系統中葡萄糖苷酶的活性對于提高果膠水解產物的速度和效率以及增加葡萄糖的年產量最為重要。因此，對葡萄糖苷酶的研究仍具有重要的理論和實用性。

黑曲霉tj02氯酸鹽的多種化學誘變方法導致了β-葡萄糖苷酶突變體des-7，并具有較高的穩定性。與原始菌株相比，des-7的酶生產能力大大提高了至少30%。在工業部門，菌株的生產能力是關鍵點之一，而因素也與產品生產的成本直接相關。分子遺傳學技術的整體發展取決于基因工程技術。分離株轉化的非凡成就取得了重大突破。因此，基因工程僅限于具有詳細遺傳基團信息和清晰代謝功能和途徑的菌株，而遺傳背景不明確的菌株是沒有辦法進行定向改造。相反，傳統的誘變育種方法如紫外線誘變育種、理化誘變育種等，不需要受到遺傳遺傳學經濟背景的限制。對硫酸二乙酯進行了化學和物理誘變育種，獲得了持續高產的芽孢桿菌，這直接證明了傳統的化學誘變方法更有效。菌株轉化是利用單一重要因子實驗結果對突變株DES-7的碳源和氮源進行充分優化的方法。當氮源為甜玉米芯，氮源為酵母粉和氯化銨時，β-葡萄糖苷酶活性為39IU/mL，比初始菌株提高了85.7%。確定了β-葡萄糖苷酶的最佳室內溫度、最適pH值、熱穩定性和pH穩定性。證明了β-糖苷酶在55℃和pH 5.0時酶活性最高，在37℃和50℃下保持良好的高可控性，在pH 4.0～6.0時穩定性較好。木質膳食纖維的蛋白質水解一般在50℃下進行，本研究獲得的突變菌株半乳糖在50℃下能保持較高的穩定性，可加入到膳食纖維酶系中用于木質粗纖維的水解[5]。

3結語

β-葡萄糖苷酶已在我國許多行業中被廣泛應用。它具有巨大的商業形式，潛力無限。發酵總體水平低一直是β-葡萄糖苷酶工業化為能生產的主要原因。當前對于提高β-葡萄糖苷酶對天然發酵過程進行了整體優化，并對菌株進行了改良。

參考文獻：

[1]蔣輝，王吉龍. 取力型變速器：，2014.

[2]周紅，張陽，宋育陽，et al. 不同啟動子及錨定蛋白對釀酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 農業生物技術學報，2020（10）.

[3]羅秀針，鄭金華，林燕燕，等. 1株灰黃霉素產生菌的誘變選育及其發酵條件優化[J]. 福建農業科技，2020（6）：12-16.

[4]周紅，張陽，宋育陽，et al. 不同啟動子及錨定蛋白對釀酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 農業生物技術學報，2020（10）：1849-1861.

[5]喻帆，方佳雙，應靈萍，等. 細菌葉綠素a高產菌株的選育和發酵工藝優化[J]. 中國抗生素雜志，2020（6）：567-572.