大鼠下頜切牙更替周期及氟化物對其影響

郭姍，李藝博，劉鑫，高黎，張彥喜

(鄭州大學第一附屬醫院 a.口腔頜面外科;b.兒童口腔科，河南 鄭州 450000)

大鼠為切牙不斷生長的嚙齒類動物，是研究牙齒發育和更新的理想實驗動物模型。以往有關于大鼠切牙萌出速率和釉質形成細胞移動速度的研究[1-2]，但對于切牙整個牙體組織更替所需的時間少見報道。氟作為人體中重要的微量元素，攝入過量可引起牙釉質出現白堊斑，出現著色甚至缺損等改變，即氟斑牙。氟斑牙是臨床常見疾病，這種前牙的著色性改變顯著影響牙齒美觀，目前常用的治療方法為有創性貼面或全冠修復等[3-4]。本實驗通過游標卡尺法測量正常及氟化物飼養大鼠下頜切牙萌出情況，明確大鼠下頜切牙更替周期及氟化物對其影響，為進一步研究氟斑牙提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備一次性口腔器械盒，眼科剪，組織鑷，持針器，手術刀片及刀柄，氟化鈉晶體(Sigma公司，美國)，去離子水，高速渦輪牙科手機(NSK，日本)，游標卡尺，電子秤，超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)，單反相機(Canon，日本)，體視顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實驗方法本實驗通過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審批(倫理審查編號2019-KY-390)。由鄭州大學實驗動物中心提供30只6周齡雄性SD大鼠[許可證號SCXK(豫)2017-0001]，質量為(200.00±20.00)g，隨機分為3組(對照組、低氟組、高氟組)，每組10只。對照組以不含氟的去離子水喂養，低氟組以50 mg·L-1的氟化鈉去離子水喂養，高氟組以100 mg·L-1的氟化鈉去離子水喂養。所有大鼠在溫度為20～25 ℃、相對濕度為50%～70%的通風環境中飼養，每天定時喂食，每組大鼠均自主飲食，喂養6周。在實驗開始當天使用高速牙科手機在大鼠右側下頜切牙遠中齊齦處刻一標記A(見圖1A)，以后每周于齊齦位置做標記(見圖1B)，分別記為B、C、D、E、F、G，用游標卡尺測量第1周萌出長度m1和第6周萌出長度m6。觀察記錄氟斑牙的發生情況。于6周末引頸處死所有大鼠，處死前用游標卡尺測量每個牙齒樣本齊齦處唇舌側厚度(見圖1C)。游標卡尺測量萌出長度的過程見圖2。取下頜切牙，清洗干凈牙齒表面黏附組織，在蒸餾水中超聲震蕩清洗5 min。

A為實驗開始時標記部位；B為實驗過程中標記部位；C為唇舌側厚度測量部位。

圖2 大鼠牙齒萌出長度測量

1.3 數據的收集收集到牙齒樣本共30顆，體視顯微鏡下(10倍)將牙齒樣本平放觀察，確定根尖及牙尖位置并拍攝牙齒全長照片(見圖3)，使用Image J軟件測量每個樣本牙齒總長度，測量3次取平均值，記為n。計算m1/n、m6/n值。

圖3 大鼠下頜切牙全長測量

2 結果

2.1 氟斑牙發生情況對照組牙齒：釉質表面光滑，呈棕黃色半透明。低氟組牙齒：釉質透明度下降，可見規則的棕白色相間的條紋狀改變。高氟組牙齒：釉質失去光澤，表面大部分呈現白堊色改變。

2.2 牙齒長度及測量值3組大鼠m1、m6、n、m1/n、m6/n、唇舌側厚度值相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠牙齒萌出長度及各測量值比較

3 討論

大鼠下頜切牙從胚胎發育到萌出過程中，發育周期較為恒定[5-6]，同時由于大鼠下頜切牙可終生不斷生長，可以模擬人牙的萌出過程[7]，因此成年大鼠也可作為研究牙齒發育不同時期的動物模型。文獻報道，影響牙齒生長萌出速率的因素很多，如萌出力量的改變、萌出阻力的改變、支持組織改建特征的變化等[8]。大鼠切牙生長速率的測量方法也有所不同，常用的有光學顯微鏡測量法和圖像分析法等[9]。本研究監測大鼠切牙更替周期時采用直接測量的方法，避免了間接從圖像中測量分析所造成的誤差，且該方法簡單，可操作性強。本實驗中，通過比較各組下頜切牙的萌出長度及牙齒總長度，發現切牙1周萌出長度大約為總長度的1/5，即大鼠切牙完成1次完整更替周期的時間約為5周，這與Angmar-M?nsson等[10]通過實驗推論出的大鼠切牙釉質35 d更新一次的觀點基本一致。該結果對開展相關實驗建模有指導意義，若使用大鼠來研究某種因素對牙齒所產生的影響時，其建模時間至少應大于5周，若該影響因素會降低切牙的生長速率，則建模時間應適當延長。

大鼠下頜切牙的唇側為牙釉質覆蓋牙本質而舌側為牙骨質覆蓋牙本質，唇側為牙冠類似物，舌側為牙根類似物，前者有釉質形成器官，不斷分泌牙釉質，后者有上皮根鞘組織，與牙體支持組織的發育有關[11-12]。大鼠下頜切牙的唇側(冠部)和舌側(根部)同時發育，釉質和牙本質發育過程可分為4個階段：前期成牙本質細胞期、牙本質基質分泌期、釉質基質分泌期和釉質鈣化期[13-14]。舌側由于缺少釉質形成器官，牙本質形成后，來自牙囊的間充質細胞進入牙齒表面分化為成牙骨質細胞，進而形成牙骨質[15-16]。大量研究證實在牙齒生長發育過程中攝入過量的氟化物可導致氟斑牙，其對牙齒的主要影響在牙釉質層，本實驗過程中也觀察到大鼠在攝入過量氟化物的情況下，僅牙釉質顏色發生明顯變化，其病變的進展過程為切牙由透亮的淡黃色外觀逐步開始改變，首先出現釉質透明度下降，之后低氟組出現白色細紋，而高氟組牙面從白色細紋改變進一步演變為白堊色斑，白堊色斑塊區域逐漸融合直至整個牙面呈現白堊色。隨著攝入氟質量濃度的增加，病變呈逐漸加重的趨勢。

比較3組大鼠切牙更替的測量結果，發現差異無統計學意義。文獻報道，牙齒生長伴隨著細胞外基質的改建，攝入過量的金屬離子可抑制參與細胞外基質改建的酶，從而影響大鼠切牙生長速率[8]。破壞切牙正常的咬合接觸關系也可使大鼠切牙的生長速率改變[17]。大鼠切牙的生長由近牙齒末端的上皮和間充質干細胞來推動[18]，攝氟狀態下并未完全破壞干細胞的再生能力，且氟化物主要對牙釉質產生影響，對于構成牙齒主體部分的牙本質來說未產生較嚴重的毒性作用[19]，氟可能不會對切牙生長造成影響。本研究結果顯示切牙生長速率未發生改變，即氟化物未影響切牙的更替周期。由于氟化物不會使切牙生長速率變慢，因此建立氟斑牙大鼠模型需要5周，不必延長建模時間。測量比較各組間切牙唇舌側厚度，差異無統計學意義，即氟化物不會影響牙釉質和牙骨質部分的生成量。從實驗開始至結束，大鼠切牙始終保持弓形形態，說明唇舌側牙釉質和牙骨質部分的形成速率也未發生相對改變。

綜上所述，大鼠下頜切牙更替周期約為5周，氟化物不會影響其更替周期及牙骨質和牙釉質形成速率。